Estimar a quantidade de EV, determinar a presença de EV e avaliar a participação e o impacto de componentes não-EV na preparação de EV exigem a caracterização de EV. A caracterização de EV enfrenta os desafios de tamanho de partícula pequeno, heterogeneidade dimensional e molecular, falta de métodos universais de identificação de EV e especificidade não-EV de muitas técnicas de medição.Nenhuma medição ou método atende a todos os requisitos de caracterização EV, por isso é recomendado usar métodos ortogonais (ou seja, métodos sem os mesmos limites de medição) para validar uns aos outros.Ou seja, os parâmetros de caracterização do EV como propriedades de massa crítica (CQA) recomendam a utilização de dois ou mais princípios diferentes para detectar o mesmo indicador.
A composição geral do EV (teor e proporção de proteínas, lípidos, ácidos nucleicos e outras biomoléculas, etc.) varia de acordo com a fonte do EV. Embora as medições dessas categorias moleculares individuais possam ser usadas para estimar a abundância de EV, esses valores não estão necessariamente relacionados com todas as concentrações de EV e não há universalidade entre os materiais de origem; Portanto,Eles não são usados como medida da concentração de EV.Assim como nenhum teste de uma única molécula pode quantificar todos os EVs, não há marcadores moleculares comuns para EVs ou subtipos de EVs. Marcadores específicos devem ser selecionados com base em evidências de especificidade de origem e tipo. Atualmente,Ainda não existe um marcador universal conhecido que possa identificar todos os EVs, independentemente de sua origem.Para os chamados exossomas, a universalidade desses marcadores ainda não é clara ou aceita. Observe que os esquemas baseados em afinidade que envolvem quatro proteínas transmembranares CD9, CD63 e CD81 não são específicos para exossomas como subtipos EV; Uma população EV enriquecida com anticorpos dirigidos a uma dessas quatro proteínas transmembranares não pode não cobrir totalmente toda a composição molecular. Além disso, nem todos os EVs expressam esses marcadores de proteína, portanto, quatro enriquecimentos de proteína transmembrana não capturam todos os EVs.Método ortogonal para detectar os mesmos parâmetros de caracterização(Mais de um princípio)É improvável ter o mesmo desvio; Por exemplo, o diâmetro do EV é deduzido e detectado por métodos ópticos e não ópticos, respectivamente.O uso de métodos ortogonais para caracterizar amostras EV também é essencial para demonstrar que o co-isolado não está relacionado com biomarcadores ou descobertas funcionais.Como muitos métodos de caracterização EV não são específicos para EV ou não são capazes de detectar todos os EV, os métodos e resultados precisam ser transparentemente publicados para garantir a repetibilidade dos dados EV.
Quantificação da concentração de partículas
A quantidade e a medição de volume de EV definem juntamente a concentração numérica (em partículas/mL), uma métrica amplamente relatada e usada. No entanto, geralmente não é confiável porque muitas tecnologias carecem de especificidade e sensibilidade para todos os EVs.O Grupo de Trabalho de Materiais de Referência EV Estritos e Padronizados da ISEV descreveu recentemente as considerações relativas à tecnologia de medição e os desafios enfrentados pela área para medir, desenvolver e relatar materiais de referência EV rastreáveis e bem caracterizados. Um destaque chave deste trabalho é a necessidade de publicar o LOD do método de detecção, permitindo que outras pessoas verifiquem os resultados, independentemente dos limites de sensibilidade.Aumenta a confiabilidade das medições de concentração EV usando métodos ortogonais，Cada método tem um LOD determinado, por exemplo, para detectar a intensidade da dispersão da luz(como NTA)intensidade de fluorescência.(como o FCM)e tamanho físico(como o RPS),Porque os métodos ortogonais não têm os mesmos limites de medição.Por exemplo, a tecnologia de detecção de pulso de resistência (RPS) pode representar o LOD em tamanho de partícula. Para técnicas ópticas como a citografia de fluxo, o LOD pode ser relatado com diâmetros derivados de modelos ópticos de dispersão de luz ou moléculas equivalentes de fluorescência solúvel (MESF) derivadas da intensidade de fluorescência. Esses métodos podem gerar dados consistentes entre diferentes instrumentos e sensibilidades. Como a detecção de partículas envolve mais variáveis,Atualmente, não há métodos para análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), dispersão dinâmica da luz (DLS).)Ou citologia de fluxo de imagem para obter LOD rastreável- É.Para tecnologias que não podem distinguir o EV de outros possíveis co-separadores ou poluentes, independentemente das etapas de separação upstream, é recomendado que o relatório de concentração seja representado como "concentração de partículas ou concentração de EP" em vez de "concentração de EV".
Quantificação do tamanho das partículas
A medição do tamanho do EV (em raio ou diâmetro nanométrico) depende de hipóteses como a esféria ou a taxa de migração, e os resultados de saída podem ser afetados por variáveis upstream. métodos comuns de alto fluxo, incluindo citologia de fluxo, NTA、RPS、 A dispersão de luz multiangular e a dispersão de luz dinâmica (DLS) assumem que o EV é esférico. Embora os termos "tamanho" e "diâmetro" sejam frequentemente usados de forma interligada entre os métodos de medição, sua derivação também pode levar a diferenças consistentes entre as técnicas de medição. Por exemplo,Tecnologias que dependem do movimento brown das partículas, como NTA ou DLS, medem o diâmetro da dinâmica dos fluidos, o que pode levar a estimativas excessivas do tamanho das partículas em comparação com métodos de imagem como o eletroscópio de frio.Há poucas formas de medir com precisão o tamanho do EV em toda a gama de diâmetros possíveis do EV (de dezenas de nanômetros a mícrons). Por exemplo, embora a imagem de alta resolução do eletroscópio de congelamento seja um dos métodos mais precisos, seu fluxo de detecção é relativamente baixo e muitos veículos eletrônicos maiores tendem a ser menos numerosos e podem não ser quantificados. A capacidade de quantificar EVs de baixo contraste abaixo de 100 nm também pode ser um fator limitante.
À medida que cada vez mais pesquisadores usam técnicas especializadas de análise de partículas individuais com maior sensibilidade, fica cada vez mais claro que muitas preparações de EV apresentam distribuições asimétricas em parte direita, como a distribuição normal logarística, onde a maioria dos EV tem diâmetros <100 nm. A maioria das técnicas de análise de partículas individuais não consegue analisar toda a população de EV, portantoPesquisadores devem compartilhar a distribuição do diâmetro do EV detectado，Não apenas indicadores agregados como tamanho médio, tamanho concentrado ou tamanho médioEstes indicadores são facilmente inclinados devido à distribuição de LOD e tamanho asimétrico. Atenção.As estatísticas de tamanho adequadas, como a medição de partículas de baixa refração por meio de NTA, podem estar mais próximas do LOD do instrumento do que do diâmetro real do modo da população EV.O uso de software com algoritmos proprietários para determinar o tamanho das partículas também pode levar a diferenças entre versões de software ou plataformas de software e, portanto, o software e suas versões também devem ser disponibilizadas.As técnicas para deduzir tamanhos a partir de hipóteses de refração podem levar a mudanças devido a diferentes componentes da amostra e cargasO tamanho derivado de uma sonda fluorescente (por exemplo, um corante incorporado em membrana) pode variar devido à incorporação de diferentes corantes com base em diferentes componentes lipídicos de membrana. Para tecnologias que não permitem distinguir entre EV e co-separador/poluente, independentemente das etapas de separação upstream, recomenda-se que o relatório de diâmetro seja apresentado como diâmetro de "partícula" ou "EP", em vez de "diâmetro EV".
Observações para relatórios específicos sobre técnicas de caracterização EV
À medida que o uso de experimentos e instrumentos de teste EV e o conhecimento especializado se expandem, a determinação de escalas de relatórios de caracterização relevantes também aumenta para garantir a confiabilidade e a repetibilidade dos dados. As diretrizes MISEV2023 detalham uma lista de precauções mínimas para experimentos e relatórios específicos do instrumento. Independentemente do design do experimento, isso geralmente se aplica. As técnicas listadas aqui não são exhaustivas e muitas técnicas de teste estão em desenvolvimento ou em pesquisa ativa. No entanto, todas as técnicas listadas estão disponíveis comercialmente e há publicações de vários pesquisadores. (Devido às limitações de tamanho, o autor lista aqui apenas as descrições de várias ferramentas de caracterização de tamanho de partícula e concentração EV atualmente usadas e suas principais perspectivas)[Celulologia de fluxo baseada em microperlas]O ISEV recomendou que o grupo de controle incluísse anticorpos homótipos como anticorpos de detecção, ou microgrânulos de captura homótipos acoplados, bem como microgrânulos de captura que contenham apenas anticorpos de detecção (grânulos de captura para envelopes de anticorpos); Devem ser usadas várias concentrações de amostragem EV para mostrar a titulação do sinal; Se as microperlas forem preparadas, seus reagentes e composição química devem ser publicados; O catálogo e os números de lote dos reagentes de microperlas capturados comercialmente também devem ser publicados; Publicar o valor médio da intensidade fluorescente das microesferas padronizadas; Publicar dados e estatísticas de intensidade de fluorescência média a partir de moléculas de fluorescência solúvel equivalente (MESF) de microesferas circulares monostáticas (do mesmo modo que a citologia de fluxo EV única); A metodologia completa e detalhada deve ser publicada.[Celulografia de fluxo EV única]Em 2023, através da iniciativa do Grupo de Trabalho de Três Sociedades (Grupo de Trabalho de Citometria de Fluxo EV), composto pela Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV), a Sociedade Internacional para o Progresso da Contagem de Células e a Sociedade Internacional de Thrombosis e Anestasia, o “Esboço de Citometria de Fluxo EV Único” foi publicado, abordando de forma abrangente as considerações para o desenvolvimento de testes de citologia de fluxo EV único.A calibração dos parâmetros de volume de amostra, fluorescência e dispersão de luz é essencial para a interpretação e replicação dos resultados de um único fluxo EV. Se a concentração de partículas é relatada usando um único citometro de fluxo EV, determine os limites superiores e inferiores do LOD para permitir o uso de métodos ortogonais ou outros para repetir e verificar os resultados.Atualmente, a citometria de imagem usa métodos de acionamento dinâmico, o que torna a determinação de LOD mais baixa difícil de definir e, portanto, difícil de padronizar.DLS， Também conhecida como espectroscopia relacionada com fótons (PCS) e dispersão de luz quasi elástica (QELS), é uma técnica capaz de determinar o diâmetro da dinâmica dos fluidos de partículas completamente dispersas em uma dispersão de solução aquática diluída. O DLS mede a função auto-relacionada da intensidade do laser dispersa por várias partículas na solução. A função correlacionada carrega informações sobre o coeficiente de difusão das partículas, que são associadas ao diâmetro da dinâmica dos fluidos através da teoria do movimento Stokes-Einstein-Brown.Os coeficientes de difusão podem ser exportados a partir de funções auto-relacionadas medidas usando vários algoritmos. O método mais comum é a análise quantitativa, masSupõe que as amostras tenham distribuições de tamanho monodispersas e que as amostras EV não tenham essa distribuição.Para a distribuição de tamanho multidisperso de amostras EV, a distribuição coeficiencial derivada da difusão de funções relacionadas torna-se um problema matemático inadequado. Isso significa...O DLS não é aplicado para determinar as propriedades quantitativas de amostras EVA menos que o DLS seja aplicado a uma parte do EV com tamanho único e descentralizado. Por outro lado, o DLS pode ser usado para confirmar qualitativamente a presença de partículas submicrônicas e possíveis agrupamentos em amostras EV.Vários microscópios eletrônicos (EM) são uma das poucas tecnologias capazes de detectar EVs (independentemente do tamanho). No entanto, o fluxo do eletroscópio também significa que os EVs maiores são estatisticamente subestimados em comparação com os EVs menores. SEM, TEM e Cryo-EM são métodos de caracterização EV de alta resolução que não precisam alternar entre si ou fornecer imagens de qualidade comparável. Por exemplo,O Cryo-EM pode mostrar claramente a estrutura de dupla camada lipídica, mantendo a forma EV melhor do que as condições de desidratação usadas para fixar amostras no TEM, e provavelmente com quantificação (tamanho) mais precisa,Porque todas as partículas em um determinado volume podem ser imagenadas, e não apenas aquelas que estão ligadas à superfície da rede.Os estudos padronizados sobre métodos EM para identificar baixos requisitos de relatório são muito limitados. Para o TEM, três parâmetros principais devem ser publicados: fixação, adsorção e métodos de coloração negativa. Fixação inclui: o fixante usado e sua concentração e tempo de incubação; A adsorção inclui o material da rede, tamanho da rede, tipo de película, revestimento, tempo de incubação e detalhes de limpeza; Os detalhes da coloração negativa devem incluir o substrato, a concentração e o tempo de incubação. Além disso, as imagens de baixa e alta magnificação e os critérios de seleção das imagens devem ser publicados.Análise de rastreamento de nanopartículasNTA， Também considerado um tipo de rastreamento de partículas individuais, é uma técnica óptica amplamente utilizada no campo dos veículos eletrônicos para estimar o tamanho e a concentração de partículas. Normalmente, o NTA usa algoritmos que reduzem a variação na distribuição do diâmetro para obter o diâmetro da dinâmica dos fluidos medindo o coeficiente de difusão das partículas. Vale ressaltar queAlgoritmos FTLA usados em certos dispositivos NTA foram desenvolvidos para representar melhor misturas monodispersas, enquanto os EV não o são, o que pode levar a distribuições de ajustes múltiplos artificiaisAlém disso, não há nenhuma maneira de determinar ou publicar o LOD das configurações NTA. Muitos acadêmicos já realizaram vários estudos padronizados para comparar os resultados entre usuários e instrumentos.A distribuição do diâmetro e a concentração de amostras de biofluidos complexos medidas com NTA devem ser interpretadas com cuidadoporque conta co-isolados como lipoproteínas e grandes complexos proteicos, eNTA tem dificuldade em quantificar EVs com diâmetros acima de algumas centenas de nanômetros- É.As informações publicadas pela NTA devem incluir o modelo do instrumento, o tipo de câmera, as configurações da câmera, o comprimento de onda do laser, a potência do laser, a versão do software, as configurações de análise e as partículas por quadro. Se for conhecido, entãoO algoritmo usado para gerar a distribuição do diâmetro deve ser publicado, pois os resultados podem ser diferentes de acordo com o algoritmo usado.Em casos de dispersão de luz ou padrões de detecção de fluorescência, recomenda-se o uso de tampão vazio como controle. Para NTA fluorescente, relatar o número total de partículas no modo de dispersão de luz e o número de partículas marcadas no modo de fluorescência, bem como o método de remoção da marca e tampão / controle de reagente para avaliar a falsificação da marca.Se um dispositivo de tipo fluido for usado, suas configurações também devem ser publicadas.- É.Esta é a primeira vez que o MISEV utiliza a tecnologia de indução de pulso de resistência (RPS) como um método comumente recomendado para a caracterização de partículas EV junto com métodos baseados em fluxo (incluindo fluxo baseado em microperlas e fluxo EV único) e métodos baseados em microscópio (incluindo microscópio de força atômica, eletroscópio, DLS, NTA, microscópio de super resolução, etc.). Também é uma das poucas técnicas de caracterização EV de princípios não ópticos.O RPS usa o princípio de Kurt para determinar a concentração e o diâmetro das partículas, e alguns dispositivos também têm uma função de potencial zeta. Atualmente, o diâmetro do RPS LOD é baixo até ~50 nm. A literatura relata,RPSOs resultados da medição são realmenteTEMOs dados são muito consistentes.Ao relatar dados RPS, recomenda-se a publicação do modelo do instrumento, da abertura, do diâmetro e da fonte da microesfera calibrada e da versão do software. Como mencionado anteriormente (quantificação do tamanho das partículas), para os dados EV,Recomenda-se publicar a distribuição do diâmetro do RPS em vez de estatísticas de diâmetro único. E recomenda-se a inclusão de um tampão vazio de controle para identificar o fundo, bem como amostras após a fissura da mesma concentração de descontaminante para determinar o evento marcado. Como a tecnologia RPS pode ser facilmente bloqueada por partículas maiores, as partículas maiores podem ser removidas usando etapas pré-analíticas como centrifugação ou filtragem. Como esses métodos podem alterar a população EV em análise e afetar a comparação com métodos ortogonais, qualquer procedimento pré-analítico deve ser claramente descrito.Informações detalhadas sobre enriquecimento e quantificação de proteínas são necessárias; Se possível, devem ser incluídos controles positivos e negativos de antígenos; Se a proteína for alegada associada ao EV, a medição da pureza da preparação do EV deve ser incluída. Relatar todos os detalhes da amostra padronizada, eletroferese em gel, método de transmembrana, sonda e imagem/análise (incluindo, mas não limitado a, informações sobre anticorpos, condições de degeneração e redução da amostra, método de transmembrana, tipo de membrana, tampão e equipamentos e parâmetros de imagem); Fornecer imagens não recortadas de todas as WB (necessárias como informações complementares se publicadas em revistas).Em cada capítulo acima, o guia discute diferentes abordagens para a caracterização de EV e fornece recomendações específicas. Independentemente do método utilizado, a recomendação geral da caracterização é resumida a seguir:
- Cada preparação de EV deve ser definida por meio de medições quantitativas da fonte de EV (por exemplo, número de células secretadas, volume de biofluidos, massa de tecidos, etc.).
- A abundância de EV deve ser estimada (incluindo o número de partículas, proteínas e/ou teor lipídico).
- Deve-se verificar a presença de ingredientes associados ao subtipo EV ou ao EV, dependendo da especificidade necessária para fins experimentais.
- Determinar o grau de presença de componentes não vesículos e co-isolados.
- Quando o EV é caracterizado com indicadores quantitativos, é necessário fornecer o limite de detecção (LOD) do instrumento ou método.
