A coluna de preparação de cromatografia HPLC é uma ferramenta importante para a separação e purificação de compostos na tecnologia de cromatografia líquida de alto desempenho.

- Tubo de coluna: geralmente feito de aço inoxidável ou vidro, com boa resistência à pressão e estabilidade química. O diâmetro interno da coluna determina o volume de enchimento e a escala de separação da coluna cromatográfica, e o diâmetro interno da coluna cromatográfica geralmente está na faixa de 50-200 mm.

- Embalagem: é a parte central da coluna cromatográfica, os embalagens comuns são silicone, óxido de alumínio, microesferas de polímeros orgânicos, etc. O preenchimento da matriz de silicone tem uma boa resistência mecânica e estabilidade química, ligando diferentes grupos funcionais (como C18, C8, C4, etc.), a separação de diferentes compostos polares pode ser alcançada.

- Placa de filtragem: localizada em ambas as extremidades do tubo de coluna, para apoiar o preenchimento e evitar vazamentos de preenchimento, garantindo que a fase de fluxo possa passar uniformemente pela coluna cromatográfica.

Etapas para a utilização da coluna de preparação de cromatografia HPLC:

1. Preparação

Verificação de segurança: Assegure a segurança da área do laboratório usando equipamentos de proteção pessoal, como roupas de laboratório, luvas e óculos de proteção.

Inspeção de instrumentos: Verifique o estado do equipamento HPLC para garantir que as colunas, detectores, bombas e outros componentes funcionem corretamente. Abra o sistema HPLC e defina a temperatura, a velocidade de fluxo e outros parâmetros adequados para que o sistema chegue a um estado estável.

Preparação da fase de fluxo: a fase de fluxo é preparada de acordo com os requisitos experimentais, filtra o solvente ou a fase de fluxo com papel de filtro de 0,2 μm e realiza a desgasificação por ultra-som para remover as bolhas e as impurezas.

Preparação da amostra: dissolva a amostra a ser testada com o solvente apropriado e dilua-a à concentração apropriada, filtrando-a também com uma membrana de filtro de 0,2 μm para garantir que a solução da amostra seja clara e livre de impurezas.

Instalação da coluna cromatográfica: instale a coluna cromatográfica de preparação no sistema HPLC, observando que a conexão deve ser apertada para evitar vazamentos. Antes da instalação, você pode verificar se a aparência da coluna cromatográfica está danificada.

Equilíbrio do sistema: lavar a coluna cromatográfica com a fase de fluxo, o tempo de lavagem geral é de 15 a 30 minutos até que a linha de base esteja estável para garantir que a coluna cromatográfica esteja cheia de fase de fluxo e alcance o estado de equilíbrio.

Determinação de amostragem: selecione o método de amostragem adequado e a quantidade de amostragem para injetar a amostra no sistema HPLC. Comece a coletar dados para registrar o tempo de retenção, largura e altura dos picos cromatográficos.

Processamento e análise de dados: com base nos dados registrados, os parâmetros relevantes da coluna cromatográfica, como o número teórico de torres, fatores de asimetria, grau de separação, etc., são calculados para avaliar o desempenho da coluna cromatográfica. Os métodos comuns de processamento de dados incluem a medição da área do pico, a medição da altura do pico, a análise quantitativa e qualitativa.

Limpeza e conservação da coluna cromatográfica: após a conclusão da medição, limpe a coluna cromatográfica com o solvente apropriado para remover as amostras residuais e a fase de fluxo. Para as colunas de cromatografia de fase inversa, geralmente é lavado primeiro com metanol ou acetonitril e depois com água pura; Para colunas de cromatografia de fase positiva, pode ser lavado com solventes orgânicos como hexano positiva. Depois da limpeza, conserve a coluna cromatográfica adequadamente para evitar secagem e poluição.