Um,PCR totalmente automáticoPreparação antes da operação
Preparação de Reagentes e Consumíveis
Reagentes: incluem modelos de DNA, precursores específicos (positivos e inversos), dNTPs (quatro nucleótidos de desoxiribose), polimerases de DNA resistentes a altas temperaturas (tais como Taq), tampões e soluções de íons Mg²+. Todos os reagentes devem ser misturados após derretimento completo para evitar erros de concentração.
Consumíveis: Use um tubo PCR estéril descartável ou uma placa de 96 buracos para garantir uma boa vedação e evitar a contaminação cruzada.
Operação de partição: Realize a configuração do sistema na área de preparação do reagente (mesa de trabalho ultra-limpa ou armário de biossegurança), use luvas durante a operação e evite falar, reduzindo a poluição por aerossóis.
Inspeção de instrumentos
Certifique-se de que o instrumento de PCR está colocado em uma plataforma horizontal robusta, que a tensão de alimentação coincide e que a terra está bem aterrizada.
Verifique se o compartimento da amostra está limpo para evitar resíduos que afetem a condução da temperatura.
Limpe regularmente o tanque de amostras com água de sabão e proíba o uso de álcalis fortes, álcool de alta concentração ou solventes orgânicos.
Preparação do sistema de reação
Reagentes misturados
Adicione o modelo de DNA, o precursor, os dNTPs, a DNA polimerase, o tampão e a solução de Mg²+ proporcionalmente a um tubo centrífugo estéril e adicione uma quantidade adequada de vapor duplo para o volume final (15-50 μL recomendado).
Parâmetros principais:
Qualidade do modelo de DNA: Evite a degradação ou a contaminação com inibidores, caso contrário, afete a eficiência da amplificação.
Projeto do precursor: assegure a especificidade, evite as estruturas diméricas ou auto-complementares e a temperatura de cozimento deve corresponder ao valor Tm do precursor.
Concentrações de Mg²+: tanto altas quanto baixas inibem a atividade enzimática e devem ser ajustadas de acordo com as instruções do reagente.
Sistema de partilha
Divida rapidamente a mistura em um tubo de PCR, tapa a tampa do tubo ou cobre uma membrana específica e centrifuge temporariamente (1000-2000 rpm, 1 minuto) para afundar o líquido no fundo do tubo.
Configuração do programa de PCR
Parâmetros do programa de temperatura
Deformação inicial: 94-98 ° C, 20-30 segundos para separar completamente a dupla cadeia do DNA.
Deformação circular: 94-98 ° C, 20-30 segundos, mantendo o estado de cadeia única.
Cozimento: 50-65 ° C, 20-40 segundos, combinando o precursor com a especificidade do modelo (a temperatura de cozimento deve ser otimizada por PCR de gradiente).
Extensão: 72 ° C, 1 min / kb fragmento de DNA, enzima Taq para sintetizar uma nova cadeia.
Número de ciclos: 20-40 vezes, ajustado de acordo com a abundância do segmento alvo.
Extensão final: 72 ° C, 5-10 minutos para garantir que todos os segmentos estejam estendidos completamente.
Temperatura de armazenamento: 16 ° C, 2 minutos (para evitar o desgaste excessivo do compressor, é proibido ajustar para 4 ° C para armazenamento indefinido).
Configurações avançadas
Gradiente de temperatura: Defina o gradiente de temperatura (por exemplo, 50-65 ° C) durante a etapa de cozimento, ao mesmo tempo em que testa várias temperaturas de cozimento para otimizar as condições experimentais.
Velocidade de aquecimento (Ramp Rate): Ajuste a velocidade de aquecimento / resfriamento (por exemplo, 3 ° C / s) para reduzir o tempo de reação.
Incremento: O aumento de temperatura ou tempo após cada ciclo (por exemplo, aquecimento de 0,1 ° C por ciclo) é aplicável a experimentos especiais, como PCR Touchdown.
Salvação e execução do programa
Depois de digitar o nome do programa para salvar, coloque o tubo de PCR no compartimento da amostra, feche a tampa térmica e gire apertado.
Inicie o programa e monitore a temperatura e o tempo em tempo real através da tela durante a execução, com suporte para pausar, pular passos ou encerrar o programa.
Tratamento pós-experimental
Análise do produto
O tubo de PCR é retirado imediatamente após a reação e o tamanho e a concentração do produto são analisados por eletroferese em gel de aglutinosa ou por fluorescência, como SYBR Green.
Se o método de marcação fluorescente for usado, certifique-se de que os parâmetros do instrumento (como comprimento de onda de excitação, valor de ganho) coincidem com o reagente para evitar interferências no sinal de fundo.
Manutenção de instrumentos
Antes de fechar o instrumento, o módulo de aquecimento deve ser resfriado naturalmente até a temperatura ambiente para evitar danos por tensão térmica.
Calibre o sensor de temperatura regularmente para garantir a precisão da temperatura (por exemplo, usando um calibrador padrão de ponto de fusão).
Limpe o compartimento da amostra e a tampa térmica, verifique se o anel de vedação está envelhecendo e substitua as peças desgastadas em tempo útil.
Cinco.PCR totalmente automáticoPrecauções
Controle da Poluição
O experimento seguiu o princípio de “livre de ácido nucleico”, usando um pipete especial, uma cabeça de arma e uma roupa de trabalho para evitar a poluição cruzada.
Estabeleça controles negativos (sem modelo) e positivos para monitorar a confiabilidade do sistema experimental.
Operações seguras
Evite abrir a tampa térmica durante a operação do aparelho de PCR para evitar queimaduras a alta temperatura ou evaporação da amostra.
É proibido o uso de líquidos corrosivos para limpar os instrumentos, evitando danos aos componentes eletrônicos.
Resolução de problemas
Sem produtos amplificadores: Verifique a qualidade do modelo, o design do precursor ou os parâmetros do programa (por exemplo, temperatura de cozimento excessiva).
Bandas não específicas: otimizar a temperatura de cozimento ou aumentar o tempo de extensão para reduzir a formação de dímeros.
Flutuações de temperatura: Entre em contato com o engenheiro para calibrar o instrumento para garantir que a uniformidade da temperatura esteja em conformidade com os padrões (por exemplo, ± 0,2 ° C).