1. Este ensaio baseia-se em GB 5009.299-2024, NY/T 4439-2023 e normas de grupos e empresas relevantes para determinar o teor de lacteferrina no leite pasteurizado, leite esterilizado a ultra-alta temperatura e fórmulas para bebês e crianças pequenas.

2. Para obter uma boa forma de pico e separação, o ensaio otimizou adequadamente as condições de pré-tratamento da amostra e cromatografia líquida, sob a temperatura da coluna de 30 ° C e a velocidade de fluxo de 1,0 mL / min.0,1% de Água Trifluoroacetato-0,1% Trifluoroacetato NitrilA lavagem gradiental é realizada como fase de fluxo e a pressão máxima do sistema não excede 106 bar.

3. Os resultados do teste mostram que a solução padrão de lacteferrina (50,0 μg / mL) tem um fator de assimetria cromatográfica de pico de 1,00, uma boa forma de pico, um número teórico de placas de torre de 30549, uma excelente eficácia de coluna; Três amostragens consecutivas, o tempo de retenção e a área de pico RSD são menores de 1%, o método é reprodutível; A relação de sinal-ruído linear mínima (1,00 μg/mL) é de 8,2, com maior sensibilidade do método; Gama linear 1,00-200 μg/mL, coeficiente de correlação linear r²≥ 0,9998, bem linear.

4. Em testes de cromatografia líquida de fase inversa para determinar o teor de lacteferrina em produtos lácteos, a coluna cromatográfica BioBasic 4 (abertura 300 Å) em combinação com o sistema de cromatografia líquida de alta eficiência Vanquish Core demonstrou uma boa reprodutividade e excelente estabilidade, com limites de detecção e limites quantitativos de métodos que atendem aos requisitos padrão e estão disponíveis para referência em empresas lácteas e laboratórios de teste de alimentos.

1.1 Extração de amostras

1.1.1Amostras líquidas: leite a temperatura baixa (leite cru, pasteurizado) / leite a temperatura normal (leite esterilizado a temperatura ultraalta (UHT))

Pese a amostra de 5 g (com precisão até 0,1 mg) em um tubo de centrifugação de 50 mL com tampão de escala, condense-a a 25,0 mL com tampão de fosfato II, extraa por oscilação por 3 min e centrifuge 12.000 rpm a 4 ℃ por 15 min. Deixe em posição a temperatura ambiente, remova a camada superior da grelha e retire o líquido para purificação.

1.1.2Amostra sólida: leite em pó (fórmula para bebês)

Pese a amostra de 2 g (com precisão até 0,1 mg) em um tubo de centrifugação de 50 mL com tampa giratória de escala, adicione a quantidade de tampão de fosfato II em solução de oscilação térmica, condense a 50,0 mL com tampão de fosfato II, extraa por oscilação turbulenta por 3 min, fique em reposição por mais de 30 min e centrifuge por 12.000 rpm a 4 ℃ por 15 min. Deixe em posição a temperatura ambiente, remova a camada superior da grelha e retire o líquido para purificação.

1.2 Limpeza da amostra

1.2.1Ativação: a coluna de afinidade da hepatina HyperSep (P/N: 60105-110-B) ligada à extremidade inferior do conector Luer ao dispositivo de extração de fase sólida, a extremidade superior ligada ao cilindro vazio da seringa de 10 mL através do adaptador (P/N: 60104-259), adicionando 2 x 5 mL de tampão fosfato II para ativar a afinidade da hepatina e controlar a velocidade de gota 2d/3s;

1.2.2Amostra acima: Quando a superfície do líquido estiver perto da placa de filtragem de coluna pequena durante a etapa de ativação, remova com precisão 10,0 mL da amostra acima para o cilindro vazio da seringa (P/N: S7510-10), controle a velocidade de gota 2d/3s e descarte o líquido de saída;

1.2.3Limpeza: quando a superfície do líquido estiver perto da placa de filtragem da coluna, adicione 2 x 5 mL de tampão fosfato II para limpeza da coluna, descarte o líquido de saída, remova o adaptador e o cilindro vazio da seringa e a coluna de secagem à pressão negativa por 2 min;

1.2.4Lavagem: Adicionar 2 x 2,5 mL de tampão fosfato I para lavar, recolher todo o líquido de lavagem e condensar com tampão fosfato I para 5,00 mL, através de 0,2 μm hidrófilo PTFE filtro de agulha (P / N: 42213-NPL), o filtro está em espera de teste.

Thermo Scientific ™ Vanquish Core ™ Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência, configuração: bomba Quaternary Pump C (VC-P20-A), amostrador automático Split Sampler CT (VC-A12-A), caixa de temperatura de coluna Column Compartment C (VC-C10-A), detector Diode Array Detector CG (VC-D11-A), processamento de dados Chromeleon ™ 7.3

Coluna cromatográfica: BioBasic 4, 5 μm, 4,6 x 250 mm (P/N: 72305-254630)

Fase de fluxo: A: 0,1% de ácido trifluoroacetico de água B: 0,1% de ácido trifluoroacetico de nitrilo

Velocidade de fluxo: 1.0 mL/min

Procedimento de limpeza de gradiente:

Volume de amostra: 50 µL

Temperatura da coluna: 30 ℃

Detector: DAD, comprimento de onda de captação: 280 nm; frequência de captação: 5 Hz; captação espectral: 190-400 nm