Tratamento pré-amostra

Configuração do instrumento e condições cromatográficas

Espectrogramas e dados

3.1 Espectrograma e dados de separação de soluções padrão misturadas de alfa-lactalulina e beta-lactalulina

Figura 1 Espectrograma e dados de separação de soluções padrão misturadas de alfa-lactalbumina e beta-lactalbumina (100 μg/mL)(Clique para ver a imagem)

Como mostrado na Figura 1, a alfa-lactalulina e a beta-lactalulina têm bons picos cromatográficos, excelente efeito de coluna e melhor separação do que o padrão. Tempo de retenção de alfa-lactoide de 21,900 min, fator de asimetria 0,98, número teórico de torres 321137; O tempo de retenção da beta-lactoglobulina B foi de 24,747 min, o fator de asimetria foi de 1,01, o número teórico de torres foi de 352.451; O tempo de retenção da beta-lactoglobulina A foi de 25,467 min, com um fator de asimetria de 1,00 e um número teórico de torres de 373359. A separação da alfa-lactalubina e da beta-lactalubina B foi de 17,77, e a separação da beta-lactalubina B e da beta-lactalubina A foi de 4,33.

3.2 Espectrograma de superposição de localização de soluções padrão única de alfa-lactalulina e beta-lactalulina

Figura 2 Espectrograma de superposição de localização de soluções padrão única de alfa-lactalulina e beta-lactoglobulina (clique para ampliar)

Cromatografia e espectrograma de localização monoscópica de alfa-lactalbumina e beta-lactalbumina, como mostrado na Figura 2, a alfa-lactalbumina, beta-lactalbumina B e beta-lactalbumina A apresentam absorção característica a 200 nm e 279 nm.

3.3 Espectrograma de sobreposição de amostragem contínua de soluções padrão de mistura de alfa-lactalbumina e beta-lactalbumina

Figura 3 Espectrograma de sobreposição de amostragem contínua em solução padrão misturada de alfa-lactalbumina e beta-lactalbumina (100 μg/mL, n=4) (clique para ampliar)

Solução padrão misturada de alfa-lactalbumina e beta-lactalbumina (100 μg/mL) com quatro amostragens consecutivas, tempo de retenção e área de pico RSD inferior a 0,3%, boa reprodutividade do método, espectro de separação e dados detalhados na Figura 3.

3.4 Espectrograma de superposição de curvas de calibração de soluções padrão de alfa-lactalbumina e beta-lactalbumina

Figura 4 Espectrograma de superposição de curvas de calibração de soluções padrão de alfa-lactalbumina e beta-lactalbumina (0,00/40,0/80,0/120/160/200 μg/mL) (clique para ampliar)

O leite cru e o leite pasteurizado geralmente apresentam níveis elevados de alfa-lactalulina e beta-lactoglobulina, o que levou à escolha da faixa linear recomendada pelos padrões de grupo T/TDSTIA 002-2021 e T/TDSTIA 007-2019. Como mostrado na Figura 4, a solução padrão de alfa-lacoproteina varia linearmente de 0,00 a 200 μg/mL, com coeficiente de correlação linear r r²≥0,9997, gama linear de soluções padrão de beta-lactoglobulina 0,00-200 μg/mL, coeficiente de correlação linear r²≥ 0,9991, bem linear. Onde beta-lactoglobulina B e beta-lactoglobulina A são quantificadas usando grupos de compostos.

3.5 Espectrograma de superposição de soluções padrão de alfa-lactoida e beta-lactoida (40,0 μg/mL) com soluções em branco

Figura 5 Espectrograma de superposição de soluções padrão de alfa-lactalbumina e beta-lactalbumina (40,0 μg/mL) com soluções em branco (clique para ampliar)

Quando o volume de amostragem é de 10 uL, com picos de alfa-lactoglobulina e beta-lactoglobulina (40,0 μg/mL) como S, a média de ruído de matriz de 22,5-24,0 min foi selecionada como N e as relações de sinal-ruído de alfa-lactoglobulina, beta-lactoglobulina B e beta-lactoglobulina A foram 523,3, 139,9 e 133,6, respectivamente, como mostrado na Figura 5. Assim, combinado com a otimização do volume de amostragem, a sensibilidade dos métodos de determinação de alfa-lactalbumina e beta-lactalbumina também pode atender aos requisitos de 1,00 μg/mL em NY/T 4630-2025.

3.6 Espectrograma de sobreposição de soluções padrão misturadas de alfa-lactalóina e beta-lactalóina com soluções de amostras de leite pasteurizadas

Figura 6 Espectrograma de superposição de solução padrão misturada de alfa-lactalóina e beta-lactalóina com solução de amostra de leite pasteurizada (clique para ampliar)

Além da proteína do soro, o leite também contém grandes quantidades de caseína e outras proteínas que podem interferir com a determinação da alfa-lactalbumina e beta-lactalbumina. Após o pré-tratamento das amostras de leite pasteurizado com pH ajustado, centrifugação de alta velocidade, etc., a alfa-lactalulina e a beta-lactalulina não alteradas são mantidas no soro superior, cujo pico de retenção de separação é melhor, a linha de base é estável e não interfere no pico, como mostrado na Figura 6. Usando o método de quantificação externa, as amostras de leite pasteurizado apresentaram 1.033,6 mg/kg de alfa-lactoida e 2.949,0 mg/kg de beta-lactoglobulina, o que corresponde basicamente aos valores da etiqueta.

3.7 Espectrograma e dados de separação de soluções de leite pasteurizado (leite a baixa temperatura), leite a alta temperatura (leite a temperatura normal) e fórmulas para bebês e crianças

A alfa-lactalulina e a beta-lactoglobulina são sensíveis à temperatura e altas temperaturas podem danificar sua estrutura química e atividade biológica. Como mostrado nas Figuras 7-9, o leite pasteurizado (leite a baixa temperatura) não possui picos de interferência óbvios perto dos picos alvo de alfa-lactalbumina e beta-lactalbumina, com precisão e quantificação, e as amostras de leite cru, leite pasteurizado e outros são aplicadas ao primeiro método NY/T 4630-2025; O leite esterilizado a ultra-alta temperatura (leite a temperatura normal) e fórmula de leite em pó para bebês e crianças existem picos de interferência óbvios perto do pico alvo da beta-lactoglobina, o que afetará gravemente os resultados qualitativos e quantitativos, o efeito da alfa-lactoglobina é relativamente pequeno, o leite esterilizado a ultra-alta temperatura, fórmula de leite em pó para bebês e crianças e crianças e outras amostras não se aplicam ao primeiro método NY / T 4630-2025, o segundo método é recomendado.

3.8 Cromatografia de penetração em gel em solução padrão de alfa-lactalulina e beta-lactalulina (segundo método)

Figura 10 Cromatografia de penetração em gel em soluções padrão de alfa-lactalulina e beta-lactalulina (500 mg/L) (clique para ampliar)

Referindo-se ao artigo "Determinação do teor de alfa-lactoide em leite, leite em pó e soro em pó por cromatografia de bloqueio volumétrico" publicado pela professora Duzhui na revista China Dairy Industry (2022), dois pilares de cromatografia de bloqueio volumétrico MAbPac SEC-1 (300 Å, 5 μm, 7,8 x 300 mm) foram usados ​​em série para lavagem uniforme em fase de fluxo de guanida 6 M para isolar eficazmente a alfa-lactoide e a beta-lactoide a 280 nm (como mostrado na Figura 10), e 60 lotes de leite, leite em pó e soro em pó foram testados para verificar a aplicabilidade e a estabilidade do método.

Especificação da coluna cromatográfica MAbPac SEC-17.8×300mm， A velocidade de fluxo recomendada é de 0,5 mL/min, com poupança de solvente garantida, opcional4.0×300Especificação da coluna cromatográfica mm, a velocidade de fluxo recomendada é de 0,2 mL/min (pode ser ajustada adequadamente, se necessário).

NY/T 4630-2025 Recomendação de materiais de consumo relacionados com a cromatografia

Referências