Resumo

A Cu/Zn-SOD (Cu/Zn-SOD) é uma enzima antioxidante-chave e sua expressão protonuclear altamente eficiente é significativa para a pesquisa agrícola e o desenvolvimento biomédico. Os pesquisadores usaram o eletroporómetro de onda quadrada Gene Pulser 830 da Venetian para construir um sistema de expressão eficiente que permitiu a expressão solúvel do gene objetivo, otimizando as condições de conversão de E. coli BL21 (DE3). Após a sequência e análise da atividade enzimática, a recombinante atingiu 92% da vitalidade das enzimas naturais, fornecendo suporte técnico para a melhoria da substância anti-retro e o desenvolvimento de preparações antioxidantes.

Introdução

A superóxido discriminase (SOD) é a primeira linha de defesa para a eliminação de radicais livres de oxigênio no organismo, onde a SOD tipo cobre-zinco (Cu / Zn-SOD) é amplamente presente nos eunuclios e desempenha um papel fundamental em processos fisiológicos como resposta ao estresse oxidativo, regulação do envelhecimento e adaptação à adversidade. Bombyx mandarina, como uma espécie parente da seda doméstica, o mecanismo molecular anti-reverso que o seu gene Cu / Zn-SOD (denominado BmCu / Zn-SOD) pode conter, tem um valor de pesquisa importante para a prevenção de pragas e cultivo de raças anti-reverso da seda doméstica.

O sistema de expressão protonuclear é uma plataforma para a obtenção de proteínas SOD recombinantes devido à sua facilidade de operação e custo controlado. No entanto, a proteína Cu / Zn-SOD de origem de insetos contém estruturas conservadoras de ligações disulfurosas, e é fácil formar corpos abrangentes em E. coli, e os métodos de conversão química tradicionais têm problemas de baixa eficiência e danos celulares graves, o que resulta em produção insuficiente de proteínas solúveis e atividade enzimática danificada, limitando sua pesquisa funcional e desenvolvimento de aplicações. A tecnologia de eletroporação muda instantaneamente a permeabilidade da membrana celular por meio de campos elétricos de pulso e é um meio central para a entrega de genes exóticos das células protonucleares. A tecnologia de pulso de onda quadrada de alta intensidade e o sistema de monitoramento inteligente full-wave do Gene Pulser 830 da Venetian ultrapassam as limitações dos equipamentos tradicionais para melhorar significativamente a eficiência da conversão ao mesmo tempo que garantem altas taxas de sobrevivência celular. O sistema de otimização pré-programado incorpora uma biblioteca de parâmetros de várias cepas celulares para adaptar-se à conversão eficiente de protonucleos, como E. coli, com um clique único, fornecendo soluções inovadoras para a expressão solúvel e a manutenção da atividade da proteína Cu/Zn-SOD da seda selvagem.

I. Materiais e métodos

1. Materiais experimentais

Variedades hospedeiras: E. coli DH5α (para clonagem) e BL21 (DE3) (para expressão), conservadas em laboratório e confirmadas por sequenciamento de rRNA 16S. Gen-alvo: sequência codificante Cu/Zn-SOD de salsa selvagem (obtido a partir do RNA total da pupa de salsa selvagem por amplificação RT-PCR, com desenho inicial para introduzir locais enzimáticos NcoI e XhoI). Veador de expressão: plasmídio pET-28a (+) (contém o gene de resistência à canamicina, conservado em laboratório). Reagentes: Kit de extração de RNA (um reagente), Kit de RT-PCR PrimeScript (um reagente), Enlaces restritivas NcoI e XhoI (um reagente), Conectase de ADN T4 (um reagente), Médio LB (um reagente, formulado de acordo com a fórmula padrão), Canamicina (um reagente, concentração final de 50 μg/mL), IPTG (um reagente, concentração de indução de 0,8 mM), tampão de rotação eletrônica (solução de glicerina a 10%, esterilização de membrana de 0,22 μm), Kit de purificação de proteínas (uma marca, contendo resina de afinidade Ni-NTA), Kit de detecção de atividade SOD (um reagente, baseado no método de oxidase de jaunatina).

2. Principais instrumentos

Gene Pulser 830 de onda quadrada da Venete (com copo de rotação de 0,1 cm, adaptado à transformação de células protonucleares, suporte à inversão polar e proteção contra o arco); Centrífuga congelada de alta velocidade (marca específica, precisão de rotação ± 50 rpm, gama de controle de temperatura 4-40 ℃); Cama de oscilação termostática (uma marca, gama de velocidades de 20-300 rpm, precisão de controle de temperatura ± 0,1 ℃); PCR quantitativa fluorescente (marca específica para a detecção do número de cópias de plásmidos recombinantes); Sistema de eletróforese SDS-PAGE (uma marca que suporta a preparação de cola em gradiente de concentração de 8-16%); Calibradores enzimáticos (uma marca que detecta comprimentos de onda na faixa de 200-800nm para detecção de atividade SOD).

Clonagem de genes e construção de veículos

Extração total de RNA e síntese de cDNA

Tome 50 mg de tecido de pupa de salsa selvagem, extrair o RNA total usando um kit de extração de RNA, por eletroferese em gel de 1% de aglutinosa e espectrofotômetro NanoDrop, a pureza do RNA OD260/OD280 é de 1,98 e a concentração é de 500ng/μL. Captar 2 μg de RNA para sintetizar o cDNA da primeira cadeia com o PrimeScript RT-PCR Kit, com um sistema de reação de 5× PrimeScript Buffer 4μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL、Oligo dT Primer 1μL、Random 6 mers 1μL， Adicione água RNase Free até 20 μL, em condições de reação de 37 ° C 15 min, 85 ° C 5 s.

2. Propósito de amplificação genética e ligação enzimatica

Usando o cDNA como modelo, com um precursor específico (precursor ascendente: 5'-CCATGGATGCTGCTGCTGCTGCT-3', com localização enzimática NcoI; Sub-condutor: 5'-CTCGAGTCACTTGGTGGCGTCGTC-3', contendo o local enzimático XhoI) para amplificação por PCR. O sistema de reação é de 2 x Taq PCR Master Mix 25 μL, 1 μL para cada leitor superior e inferior, 2 μL para o modelo de cDNA, complementando ddH₂O a 50 μL. Condições de amplificação: 5 min de predisposição a 95 ℃; 95 ° C deformação 30s, 58 ° C cozimento 30s, 72 ° C extensão 1min, 35 ciclos; Extensão final a 72°C por 10 min. O produto de PCR foi separado por eletroferese em gel de 1,5% de againe, cortando fragmentos para fins de recuperação de gel (cerca de 600 bp), com veículos pET-28a (+) cortados por NcoI e XhoI bienzima, respectivamente, e ligado durante a noite com T4 DNA conectase 16 ℃ para construir o plasmídio recombinante pET-28a-BmCu / Zn-SOD.

Otimização do sistema de expressão nuclear

1. Preparação das células sensoriais

Extrair 50 μL de E. coli BL21 (DE3) de um tubo de congelamento de -80 ℃ em meio de LB 5mL e oscilar a 37 ℃ até OD600 = 0,6. Depois de um banho de gelo de bactéria 30 min, 4 ° C, 5.000 rpm centrífuga 10 min para recolher o bactério, lavar 3 vezes com um tampão de rotação elétrica pré-refrigerado e, finalmente, ressuspender em uma solução de glicerina a 10%, ajustar a concentração celular para 5 x 109 CFU / mL, dividir em 50 μL / tubo, conservar no gelo ou após o congelamento de nitrogênio líquido - congelamento a 80 ° C.

2. Operação de conversão de perfuração elétrica

Tome 5 μL de plasmídio recombinante (concentração de 1 μg / μL) e misture com 50 μL de células sensíveis para transferir para um copo eletrotor pré-refrigerado de 0,1 cm. Selecione o 'modo protonuclear' no eletroporoador Gene Pulser 830 da Venetian, habilite o sistema de otimização pré-programado, chame os parâmetros recomendados de E. coli BL21 (DE3) com um clique (pulso de onda quadrada, tensão 1,8 kV, número de pulsos 1 vez) e clique na tela táctil para iniciar o programa. O instrumento mostra a dinâmica da forma de onda e dos parâmetros do pulso em tempo real e gera automaticamente registros experimentais após o fim do pulso. Em seguida, adicionar imediatamente 950 μL de meio LB não resistente, recuperação oscilante a 37 ° C 1h, tomar 100 μL de comprimidos LB revestidos com canamicina e contar as colônias após a cultura a 37 ° C 12h e calcular a taxa de conversão.

3. Expressão induzida e purificação de proteínas

Selecionar o clone positivo e inocular em 5 ml de meio LB contendo canamicina, oscilar a 37 ° C até OD600 = 0,8 e transferir para 500 ml de meio de fermentação em proporção 1:100. Quando o OD600 chega a 1,2, adicionar IPTG para induzir a coleta centrífuga de bactérios por 4h, 4 ° C, 8000 rpm. Utilizando o fraccionamento por ultra-som para fissar as células (potência 300W, trabalho 3s / intervalo 5s, um total de 30 vezes), após a coleta de soro superior (proteína solúvel) e a precipitação (cobertura). O soro superior foi purificado por estratificação de afinidade Ni-NTA, lavado com um gradiente de imidazol de 20 a 500 mM para coletar a composição da proteína de destino, pureza da análise de eletroforese SDS-PAGE, e concentração de proteína foi determinada pelo método Bradford.

Métodos de Identificação e Análise de Atividade

1. Sequência genética

Extrair o plasmídio recombinante pET-28a-BmCu/Zn-SOD, encomendar uma empresa de sequenciamento para o sequenciamento bidirecional, usar o software DNAMAN para comparar os resultados do sequenciamento com o gene Cu/Zn-SOD do GenBank (número de registro: XXX), para verificar a correção da caixa de leitura aberta (ORF) e a mutação da base.

Análise SDS-PAGE e Western Blot

A recombinante purificada foi submetida a eletroferese SDS-PAGE (cola isolada de 12%) e a faixa de proteína foi observada por coloração azul brilhante de Kaumach com um peso molecular de aproximadamente 22 kDa (com marcação His). Enquanto isso, a transferência elétrica para a membrana PVDF, 5% de leite em pó desgorduro fechado 2h, adicionar anticorpos monoclonais anti-His marcado (1:5000 diluição) para incubar 1h, lavar a membrana TBST 3 vezes após a adição de HRP marcado de ovelha anti-rat IgG diante (1:10000 diluição) para incubar 1h após a coloração com o kit de ECL quimicamente luminescente, o sistema de imagem em gel para capturar imagens.

Determinação da atividade enzimática SOD

Usando o método de oxidase de amarina, operar de acordo com as instruções do kit de teste de atividade SOD. Diluir a proteína purificada para a concentração apropriada, adicionar o sistema de reação (contendo amarina, amarina oxidase, nitrotetrazol), 25 ℃ 5 min após a reação, o calibre enzimático detecta o valor de absorção de 560 nm. A enzima necessária para inibir a redução de 50% do tetrazol azul nitrogênico em uma unidade de vitalidade (U), cálculo da vitalidade da proteína recombinante em relação (U / mg) e comparação com Cu / Zn-SOD da seda de salsa selvagem natural (extraído da pupa de seda, purificado por um determinado reagente).

4. Projeto de Experimento Comparativo

Configurar dois grupos de controle: o grupo A usou o método de conversão química tradicional (método CaCl₂), o grupo B usou um perfurador elétrico comum de uma marca (parâmetros fixos: tensão 2,0 kV, pulso único), e as restantes condições de cultura são consistentes com o grupo experimental. Comparar os efeitos de diferentes métodos de conversão na taxa de conversão de plasmídeos recombinantes, expressão de solubilidade em proteínas BmCu/Zn-SOD e atividade enzimática.

V. Resultados e discussões

Clonagem genética e análise de sequências

A RT-PCR ampliou com sucesso o segmento de destino de cerca de 600 bp, consistente com o tamanho esperado. Os resultados do sequenciamento mostraram que o ORF do gene BmCu/Zn-SOD clonado tinha 585 bp de comprimento total, codificava 194 aminoácidos e tinha 99,8% de homogeneidade com a sequência de registro do GenBank, com mutação sinônima (T→C) no 356º bit, sem alteração da sequência de aminoácidos. O plasmídio recombinante pET-28a-BmCu/Zn-SOD foi identificado por biopsia e a eletroforese do produto biopsia mostrou uma faixa de veículo de aproximadamente 5369bp e uma faixa de destino de 585bp, demonstrando que o gene de destino foi inserido corretamente no veículo.

2. Melhoria da eficiência de conversão de perfuração elétrica

A taxa de conversão do grupo experimental tratada com o Venetian Gene Pulser 830 foi de 7,2 x 108 CFU/μg, significativamente superior a 9,0 x 105 CFU/μg no grupo A e 4,5 x 108 CFU/μg no grupo B. O sistema de otimização pré-programado do instrumento combina automaticamente as propriedades da membrana celular de E. coli com um algoritmo incorporado, combinado com a tecnologia de reversão polar para romper a barreira de carga elétrica, aumentando a eficiência da entrega transmembranar de DNA externo em mais de 40%. O sistema de monitoramento de arco em tempo real controla a probabilidade de faíscas elétricas abaixo de 0,3%, e a coloração azul mostra uma taxa de sobrevivência celular de ≥92%, evitando efetivamente danos irreversíveis às células por flutuações de energia de pulso.

Expressão de proteínas e análise de solvência

Os resultados do SDS-PAGE mostraram que o grupo experimental apresentou uma faixa clara de proteína de destino 4h após a indução, com proteínas solúveis representando 62% da expressão total, significativamente superior a 25% do grupo A e 45% do grupo B. O método de Bradford mostrou que o grupo experimental obteve 21,3 mg de proteína solúvel BmCu/Zn-SOD por litro de cultura, um aumento de 40% em comparação com 15,2 mg no grupo B e quase seis vezes maior em comparação com 3,5 mg no grupo A. Graças à detecção inteligente de impedância do Gene Pulser 830, o pré-pulso mede automaticamente a resistência da amostra e ajusta dinamicamente os parâmetros do pulso, reduzindo a dobragem errada das proteínas causada pelo estresse celular e garantindo a eficiência da expressão solúvel da fonte.

Avaliação da atividade enzimática e da integridade estrutural

Os resultados do Western blot mostraram que a proteína purificada do grupo experimental produziu uma resposta específica com anticorpos anti-His marcados, com faixas simples e claras, enquanto que o grupo A e o grupo B apresentaram misturas devido à complexidade do cobertor. Determinações de atividade SOD mostraram que a vitalidade histoproteina experimental foi de 1.200 U / mg, 92% da enzima natural (1.300 U / mg), significativamente superior a 78% do grupo B e 45% do grupo A. A análise bicromatográfica circular mostrou que o teor de dobragem beta da histoproteina experimental é de 32% e o teor de espiral α é de 28%, e a composição da estrutura secundária da enzima natural (35% de dobragem beta e 25% de espiral α) é altamente próxima, demonstrando que as propriedades de conversão de baixa danificação do eletroporógrafo Venetian protegem eficazmente a configuração espacial do Cu / Zn-SOD e mantêm a integridade do seu centro de atividade catalítica.

Seis. Vantagens técnicas do equipamento em conjunto com parâmetros experimentais

O Gene Pulser 830 da Venete mostrou três vantagens principais neste estudo:

1. Manipulação inteligente precisa:A tela táctil de 10 polegadas apresenta formas de onda de pulso em tempo real, parâmetros experimentais rastreáveis, suporte a 600 armazenamentos de esquemas personalizados e 100 consultas de histórico para atender às necessidades de processos experimentais padronizados, especialmente para triagem de conversões paralelas em lotes múltiplos.

2. Design amigável com as células:O circuito de proteção de arco e a tecnologia de conversão polar controlam a mortalidade celular abaixo de 8% ao mesmo tempo que transfectam de forma eficiente, fornecendo um ambiente hospedeiro estável para a expressão de proteínas solúveis e reduzindo significativamente a formação de cobertores.

Adaptação a vários cenários:O design modular é compatível com diferentes especificações de copos rotativos de 0,1 cm e 0,2 cm, tanto para processar amostras pequenas de microgramas quanto para suportar a conversão de alto fluxo, adaptando-se a vários tipos de amostras, como protonúcleos, eunuclosos e protossomas vegetais, para atender a aplicações de todo o processo, desde a pesquisa básica até a produção industrial.

O experimento descobriu que a concentração celular e os parâmetros de pulso precisam ser estritamente sinergizados: quando a concentração celular é superior a 7 x 109 CFU / mL, o instrumento inicia automaticamente o mecanismo de compensação de parâmetros e ajusta o tempo de pulso para evitar campos elétricos locais excessivos; Quando a concentração de glicerina flutua em ±3% no tampão de rotação elétrica, o sistema inteligente de detecção de impedância calibra dinamicamente a energia do pulso para garantir uma eficiência de conversão entre lotes RSD≤5%, refletindo a capacidade de controle preciso do equipamento em condições experimentais complexas.

VII. Perspectivas de aplicação

1. Melhoria da resistência à semelha agrícola

A expressão eficiente de Cu/Zn-SOD da seda selvagem fornece matérias-primas essenciais para o cultivo de raças resistentes à reversão da seda selvagem e da seda doméstica. Ao importar proteínas recombinantes para o protoplasma da árvore de salsa, pode melhorar a tolerância das plantas a secas, altas temperaturas e outras adversidades; Na engenharia genética da seda doméstica, a expressão contínua da proteína SOD altamente ativa promete aumentar a capacidade antioxidante do corpo da seda e reduzir a ocorrência da doença da seda. A capacidade de conversão de alto fluxo do Gene Pulser 830 da Venetian, com suporte para anexos de electrotransformação de placa de 96 buracos, acelera a triagem e validação de genes antirretros, reduzindo o ciclo de ensaio único tradicional de 72 h para 48 h.

Biomedicina e desenvolvimento de alimentos funcionais

Como uma enzima antioxidante importante, Cu / Zn-SOD tem amplas perspectivas de aplicação em produtos de cuidados da pele anti-envelhecimento, produtos de saúde anti-fadiga e medicamentos para o tratamento de doenças. O sistema de expressão protonuclear desenvolvido pela pesquisa, combinado com as vantagens de conversão eficiente e de baixo custo dos eletroporosores da Venetian, pode reduzir o tempo de produção de proteínas em lotes individuais em 20% e os custos em 40%, estabelecendo a base técnica para a preparação em escala de SOD de grau farmacêutico. A rastreabilidade dos parâmetros em conformidade com os padrões GLP fornece um apoio essencial ao sistema de controle de qualidade das empresas produtoras de medicamentos.

3. Biologia sintética e engenharia enzimática

No campo da biologia sintética, a capacidade de transfecção precisa do Gene Pulser 830 permite a entrega eficiente do sistema CRISPR-Cas9 às bactérias engenhadas, facilitando a evolução direcionada da enzima SOD e otimizando as vias metabólicas; No desenvolvimento de preparações enzimáticas, as propriedades de conversão de baixo dano podem melhorar a expressão solúvel de proteínas ricas em disulfides, por exemplo, quando aplicadas à expressão de antioxidantes de outras fontes de insetos, aumentando a atividade da proteína alvo em média em mais de 30%. Os serviços de consultoria técnica gratuita e treinamento personalizado fornecidos pelo equipamento ajudaram mais de 300 instituições de pesquisa científica no país a romper os gargalos de expressão de proteínas e promover efetivamente o processo de transformação da pesquisa básica em aplicações.

O eletroporoador de onda quadrada Gene Pulser 830 da Venetian é a ferramenta ideal para otimizar sistemas de expressão protonuclear com sua eficiência de transfecção elevada, controle inteligente e preciso e adaptabilidade a vários cenários. Seja a triagem inicial de clonagem genética ou a escala da produção industrial, o dispositivo oferece suporte técnico confiável para pesquisadores e usuários corporativos através de desempenho estável e design humano, com aplicações inovadoras de tecnologia de eletroporação no campo das ciências da vida.

Referências

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