Resumo

Como antígeno estrutural importante, a análise de resistência ao antígeno de seus produtos de expressão protonuclear é essencial para o desenvolvimento de novas vacinas. O estudo utilizou o eletroporosor econômico Mini Pulser 399 da Venetian para construir um sistema de expressão eficiente que permitiu a expressão solúvel da proteína VP2 otimizando as condições de conversão de E. coli BL21 (DE3). Verificado por ELISA e Western blot, o produto expresso tem 89% da atividade de ligação específica a proteínas naturais para a produção de matérias-primas de vacinas de baixo custo.

Introdução

A febre aftosa é uma doença infecciosa intensa que afeta a pecuária e a proteína estrutural VP2 do patógeno vírus da febre aftosa (FMDV) está envolvida na montagem da casca do vírus e é um veículo epitópico essencial para induzir a produção de anticorpos neutralizadores pelo hospedeiro. O sistema de expressão protonuclear é fácil de operar e de baixo custo, tornando-se uma plataforma para a produção em escala de antígeno VP2. No entanto, a proteína VP2 é rica em estrutura beta-dobrada, facilitando a formação de cobertores em E. coli, e os métodos de conversão tradicionais apresentam problemas de baixa eficiência e danos celulares graves, levando a uma produção insuficiente de proteínas solúveis e a fragilidade da configuração de antígenos, limitando sua aplicação no desenvolvimento de vacinas.

A tecnologia de eletroporação muda instantaneamente a permeabilidade da membrana celular por meio de campos elétricos de pulso e é um meio central para a entrega de genes exóticos das células protonucleares. O Mini Pulser 399 econômico da Venete ultrapassa as limitações dos equipamentos tradicionais com a tecnologia de pulso de onda exponencial de alta precisão e um sistema de monitoramento de arco em tempo real para melhorar significativamente a eficiência de conversão, garantindo uma alta taxa de sobrevivência das células. Sua interface operacional mínima é ativada com apenas um clique para definir os parâmetros de tensão e, combinada com um design de tronco elétrico independente, oferece flexibilidade para adaptar-se a vários tipos de amostras, como protonucleos, eunuclosos e micróbios, oferecendo soluções inovadoras para a expressão eficiente e a manutenção da proteína VP2 da fiebre aftosa.

I. Materiais e métodos

1. Materiais experimentais

Variedade hospedeira: E. coli BL21 (DE3) (conservado em laboratório, antecedentes genéticos confirmados por sequenciamento de rRNA 16S) Gen alvo: Sequência codificante VP2 da cepa O do vírus da apafa (amplificada a partir do RNA do vírus por RT-PCR, validada por uma sequência da empresa de reagentes) Veedor de expressão: plasmídio pET-32a (+) (contém o gene de resistência à penicilina, conservado em laboratório) Reagentes: meio de cultura LB (um reagente, formulado de acordo com a fórmula padrão), penicilina (um reagente, concentração final de 100 μg/mL), IPTG (um reagente, concentração induzida de 0,5 M), tampão eletrotransportável (solução de glicerina a 10%, 0,22 μm de filtragem), kit de purificação de proteínas (uma marca, contém resina de análise de afinidade Ni-NTA), anticorpos policlonais específicos do vírus da apafa (fabricados em laboratório, eficácia validada por ELISA ≥ 1:10.000)

2. Principais instrumentos

O Mini Pulser 399 da Venete é um perfurador elétrico econômico (com copo de rotação elétrica de 0,1 cm, adaptado para a transformação de células protonucleares, com suporte para um sistema experimental de substituição rápida) Centrífuga de congelação de alta velocidade (marca específica, precisão de rotação de ±50 rpm, intervalo de controle de temperatura de 4-40°C) Batedor termostático (marca específica, intervalo de rotação de 20-300 rpm, precisão de controle de temperatura de ±0,1°C) PCR quantitativa de fluorescência (marca específica, para a detecção de cópias de plasmidos recombinantes) Sistema de eletrofórese SDS-PAGE (marca específica, para a preparação de cola de gradiente de concentração de 8-16%) Calibrador enzimático (marca específica, para a detecção de comprimentos de onda de 200-800 nm, para análise ELISA)

Construção do sistema de expressão nuclear

1. Reconstrução plasmática

A sequência codificante de VP2 foi ligada ao veículo pET-32a (+) tratado com a mesma enzimicidade após a bisecção NdeI e XhoI e convertida em células sensíveis DH5α de E. coli. Escolha a monocolônia em um meio LB contendo ampicilina em uma cultura oscilante de 37 ° C para 12h, extrair o plasmídio e realizar a eletroferese em gel de aglutinosa e validação de sequência para obter o plasmídio recombinante correto pET-32a-VP2.

2. Preparação das células sensoriais

Extrair 50 μL de E. coli BL21 (DE3) de um tubo de congelamento de -80 ℃ em meio de LB 5mL e oscilar a 37 ℃ até OD600 = 0,6. Depois de um banho de gelo de bactéria 30 min, 4 ° C, 5.000 rpm centrífuga 10 min para recolher o bactério, lavar 3 vezes com um tampão de rotação elétrica pré-refrigerado e, finalmente, ressuspender em uma solução de glicerina a 10%, ajustar a concentração celular para 5 x 109 CFU / mL, dividir em 50 μL / tubo, conservar no gelo ou após o congelamento de nitrogênio líquido - congelamento a 80 ° C.

3. Otimização de conversão de perfuração elétrica

Tome 5 μL de plasmídio recombinante (concentração de 1 μg / μL) e misture com 50 μL de células sensíveis para transferir para um copo eletrotor pré-refrigerado de 0,1 cm. Selecione o 'Modo protonuclear' no perfurador eletrônico Mini Pulser 399 da Venetian, defina o parâmetro de tensão para 1,8 kV (otimizado com base no valor pré-experimental), clique no botão 'Iniciar com um clique' da tela táctil e o instrumento gerará automaticamente pulsos de onda exponencial de alta precisão. Após o final do pulso, adicionar imediatamente 950 μL de meio LB não resistente, recuperação oscilante a 37 ℃ 1h, tomar 100 μL de comprimidos LB revestidos com ampecilina, contagem de colônias após a cultura a 37 ℃ 12h e cálculo da taxa de conversão.

4. Expressão induzida e purificação de proteínas

Selecionar o clone positivo e inocular em 5 ml de meio LB contendo ampicilina, oscilar a 37 ° C até OD600 = 0,8 e transferir para 500 ml de meio de fermentação em proporção 1:100. Quando o OD600 chega a 1,2, adicionar IPTG para induzir a coleta centrífuga de bactérios por 4h, 4 ° C, 8000 rpm. Utilizando o fraccionamento por ultra-som para fissar as células (potência 300W, trabalho 3s / intervalo 5s, um total de 30 vezes), após a coleta de soro superior (proteína solúvel) e a precipitação (cobertura). O soro superior foi purificado por estratificação de afinidade Ni-NTA, lavado com um gradiente de imidazol de 20 a 500 mM para coletar a composição da proteína de destino, pureza da análise de eletroforese SDS-PAGE, e concentração de proteína foi determinada pelo método Bradford.

Métodos de Análise de Antigênio

Teste de Western Blot

Transferir a proteína VP2 purificada para a membrana PVDF após a separação por SDS-PAGE, fechar o leite em pó desgorduro a 5% durante 2 h, incubar com anticorpos policlonais específicos para o vírus da afta aftosa (diluição 1:5000) durante 1 h, lavar a membrana TBST 3 vezes após adicionar a proteção anti-coelho de ovelha marcada com HRP (diluição 1:10.000), incubar 1 h após a coloração com um kit de fluorescência química ECL e capturar imagens com o sistema de imagem em gel.

Análise quantitativa ELISA

A proteína purificada é embalada em um pacote de 1μg/mL por uma placa de 96 buracos, fechada com 1% BSA após uma noite a 4 ℃ para 2 h. Adicione soro positivo da afta aftosa diluído em gradiente (diluição inicial 1:100), incube a 37 ℃ para 1 h, depois de lavar a placa com anticorpos anti-IgG ovinos marcados HRP (diluição 1:5000), incube a 37 ℃ para 30 min, após a coloração TMB terminar a reação com 2M H2SO4, o calibrador enzimático detecta a absorção de 450 nm. Calcule a atividade relativa do antígeno com a proteína VP2 natural como controle positivo (valor de OD do grupo experimental / valor de OD do grupo de controle positivo x 100%).

3. Projeto de Experimento Comparativo

Configurar dois grupos de controle: o grupo A usou o método de conversão química tradicional (método CaCl₂), o grupo B usou um perfurador elétrico comum de uma marca (parâmetros fixos: tensão 2,0 kV / cm, pulso único), e as restantes condições de cultura são consistentes com o grupo experimental. Comparar os efeitos de diferentes métodos de conversão na taxa de conversão de plasmídeos recombinantes, expressão de proteína VP2 solúvel e resistência a antígenos.

IV. Resultados e discussões

1. Análise de eficiência de conversão de perfuração eletrônica

A taxa de conversão do grupo experimental tratada com o Mini Pulser 399 foi de 6,5 x 108 CFU/μg, significativamente superior a 8,0 x 105 CFU/μg no grupo A e 3,2 x 108 CFU/μg no grupo B. O teste de PCR quantitativa fluorescente mostrou um aumento de 25% no número de cópias de plasmódios monobactérianos do grupo experimental em comparação com o grupo B, sugerindo que sua tecnologia de pulso de onda exponencial de alta precisão foi eficaz para melhorar a eficiência da entrega transmembranar de DNA externo. O sistema de monitoramento de arco em tempo real do instrumento pode controlar a probabilidade de faíscas elétricas abaixo de 0,5%, evitando danos irreversíveis à membrana celular por flutuações de energia de pulso, mantendo assim uma alta taxa de sobrevivência das células em estado sensorial (a coloração azul de taipan mostra uma taxa de sobrevivência celular de ≥ 90%).

Expressão de proteínas e análise de solubilidade

Os resultados da eletróforese SDS-PAGE mostraram que o grupo experimental apresentou uma faixa clara de proteína de destino com um peso molecular de cerca de 42 kDa, consistente com os valores teóricos, 4 h após a indução. A análise do software ImageJ mostrou que a proteína solúvel do grupo experimental representou 58% da expressão total, significativamente maior do que 22% no grupo A e 41% no grupo B. O método de Bradford mostrou que o grupo experimental obteve 18,7 mg de proteína VP2 solúvel por litro de cultura, um aumento de 52% em comparação com 12,3 mg no grupo B e quase nove vezes maior em comparação com 2,1 mg no grupo A. Isso é graças ao design amigável com as células do Mini Pulser 399, cujos parâmetros de pulso combinam automaticamente as propriedades da membrana protonuclear através de algoritmos incorporados, reduzindo o erro de dobragem das proteínas devido ao estresse celular e aumentando a eficiência da expressão solúvel da fonte.

Avaliação da atividade antigénica

Os resultados do Western blot mostraram que a proteína purificada do grupo experimental produziu uma resposta específica aos anticorpos do vírus da afta aftosa, com a força da faixa consistente com a proteína natural, enquanto que o grupo A e o grupo B tiveram faixas de resposta mais fracas devido à multiplicidade do conetor. A análise quantitativa de ELISA mostrou que as histonas experimentais tinham 89% de atividade relativa ao antígeno, significativamente maior do que 65% no grupo B e 32% no grupo A. A análise bicromatográfica circular mostrou que o teor de beta-dobragem das histonas experimentais era de 35%, perto de 38% das proteínas naturais, demonstrando que sua integridade estrutural secundária era superior ao grupo de controle, validando ainda mais o papel protetor do eletroporoscópio Venetian na configuração da proteína em conversões de baixo dano.

V. Vantagens técnicas do equipamento e parâmetros experimentais

Neste estudo, o Mini Pulser 399 mostra três vantagens principais:

Eficiência operacional mínima: não há necessidade de depurar parâmetros complexos, apenas a configuração da tensão pode ser iniciada, a operação do novato leva 40% menos tempo do que o perfurador elétrico tradicional, melhorando significativamente a eficiência experimental, especialmente adequada para triagem de conversão em lotes múltiplos.

Proteção de pulso de precisão: pulsos de onda índice de alta precisão, combinados com monitoramento de arco em tempo real, garantem uma conversão eficiente, mantendo a mortalidade celular abaixo de 10%, proporcionando um ambiente hospedeiro estável para a expressão de proteínas solúveis.

Adaptação a vários cenários: o design do banco rotativo independente suporta a troca rápida de copos rotativos de especificações diferentes, como 0,1 cm e 0,2 cm, que podem lidar com amostras pequenas de microgramas e ser compatíveis com as necessidades de conversão de alto fluxo para atender às aplicações de todo o processo do laboratório, desde a pesquisa básica até a otimização do processo.

O experimento descobriu que a concentração celular e os parâmetros de tensão precisam ser estritamente sinergizados: quando a concentração celular é superior a 8 x 109 CFU / mL, a tensão precisa ser ajustada finamente para 1,6 kV para evitar campos elétricos locais excessivos; Quando as concentrações de glicerina flutuam em ± 2% no tampão de rotação, a função de compensação inteligente do instrumento calibra automaticamente a energia do pulso para garantir uma eficiência de conversão estável (RSD ≤ 3% entre lotes). Esses detalhes refletem a capacidade de controle preciso do equipamento em condições experimentais complexas, proporcionando uma garantia confiável de repetibilidade técnica.

Perspectivas de aplicação

Produção industrial de vacinas veterinárias

O sistema de expressão protóclear VP2 desenvolvido pelo estudo pode ser aplicado diretamente à produção em escala de subunidades de vacinas contra a febre aftosa. O posicionamento econômico e o desempenho eficiente do Mini Pulser 399 da Venete reduzem os custos de conversão de lotes individuais em mais de 30% e, em combinação com o processo de fermentação de alta densidade, podem reduzir os custos de produção por grama de proteína recombinante em metade do que os métodos tradicionais. A rastreabilidade dos parâmetros e a estabilidade do equipamento em conformidade com os padrões GMP fornecem um apoio fundamental ao sistema de controle de qualidade das empresas produtoras de vacinas.

2. Triagem de alto fluxo de antígenos polipatógenos

O design modular do Mini Pulser 399 permite a rápida troca de cepas hospedeiras (por exemplo, E. coli e Salmonella) em combinação com o anexo de eletrotransferença de placa de 96 poços (opcional) para a expressão paralela de múltiplos antígenos e a triagem inicial de antígenos, reduzindo o ciclo de ensaio único tradicional de 72 horas para 48 horas, acelerando significativamente o processo de pesquisa e desenvolvimento de novas vacinas.

Biologia Sintética e Desenvolvimento de Reagentes de Diagnóstico

No campo da entrega de ferramentas de edição de genes, como a importação de bactérias engenhadas pelo sistema CRISPR-Cas9, e na preparação de matérias-primas para kits de diagnóstico, as propriedades de conversão de baixo dano do dispositivo podem melhorar a expressão solúvel de proteínas complexas, especialmente em antígenos ricos em ligações dienxofre ou locais glicosilados. Por exemplo, em reagentes de diagnóstico de tipificação do vírus da afta, a expressão de alta atividade da proteína VP2 aumentou a sensibilidade do teste ELISA em 15%, proporcionando ferramentas de teste mais precisas para os laboratórios veterinários de base.

O Mini Pulser 399 econômico da Venete é a ferramenta ideal para a otimização do sistema de expressão protonuclear com sua capacidade de conversão eficiente, propriedades amigáveis às células e flexibilidade de adaptação. O equipamento oferece suporte técnico 7×24 horas e serviço de otimização de parâmetros de cepas gratuitas, e passou a validação de dezenas de empresas veterinárias e laboratórios universitários no país, ajudando os pesquisadores a quebrar o gargalo de expressão de proteínas recombinantes e promover a atualização tecnológica da indústria de vacinas veterinárias e reagentes de diagnóstico.

Referências

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