Resumo

O polisacar da proteína central é de grande valor na reparação de tecidos e no estudo dos mecanismos da doença, mas sua expressão protonuclear enfrenta problemas como baixa eficiência de conversão e atividade proteica danificada. Este estudo construiu um sistema de expressão protonuclear altamente eficiente com o eletroporômetro de energia dual-onda Gene Pulser X2 da Venetian. A otimização das condições de conversão de E. coli BL21 (DE3) através da tecnologia de sinergia de duas ondas aumentou a taxa de conversão de plasmídeos recombinantes em 40%, fornecendo suporte técnico para a produção em escala de polisacárias de proteínas de núcleo altamente ativas.

Introdução

Decorin, como um componente importante da matriz extracelular, desempenha um papel fundamental na regulação da formação de fibras de colágeno e na inibição da proliferação das células tumorais, e seus produtos de expressão recombinante mostram amplas perspectivas de aplicação em materiais de reparação de trauma e desenvolvimento de medicamentos anti-tumorais. No entanto, problemas como o efeito de barreira da membrana celular no sistema de expressão protonuclear, a baixa eficiência da importação de plasmídeos recombinantes e a formação de enconsores de proteínas durante o processo de expressão induzida, levam a baixa produção de proteínas alvo e dificuldades de manutenção da atividade, tornando-se um gargalo de garrafa que limita seu desenvolvimento industrial.

A tecnologia de eletroporção, como um meio central para a entrega de genes de células protonucleares, altera instantaneamente a permeabilidade da membrana celular através de campos elétricos de pulso, permitindo a importação eficiente de DNA externo. O electroperforador dual de energia Gene Pulser X2 da Venetian ultrapassa as limitações das tecnologias tradicionais de transfecção, integrando a inovadora tecnologia de sinergia de duas ondas com sistemas de proteção inteligentes para combinar com precisão a combinação adequada de ondas quadradas e ondas exponenciais para as propriedades da membrana das células protonucleares, garantindo uma alta taxa de sobrevivência das células e melhorando significativamente a eficiência da transformação. Seu banco de dados integrado de mais de 200 cepas celulares, que contém hospedeiros de expressão protonuclear comuns, como E. coli e Salmonella, combinado com um sistema de pré-otimização inteligente, fornece uma solução revolucionária para a construção de sistemas de expressão de poliglicoproteinas de núcleo altamente eficientes e estáveis.

Materiais e métodos

1. Materiais experimentais

Variedade hospedeira: E. coli BL21 (DE3) (conservado em laboratório, com antecedentes genéticos claramente verificados por sequenciamento) Gen alvo: sequência codificante de poliglicoproteínas humanas (clonada a partir de fibroblastos normais por RT-PCR e sequenciada por uma empresa de reagentes para confirmar que a sequência é correta) Veedor de expressão: plasmídio pET-28a (+) (com gene resistente à canamicina, conservado em laboratório) Reagentes: meio de cultura LB (um reagente, formulado de acordo com a fórmula padrão), canamicina (um reagente, concentração final de 50 μg/mL), IPTG (um reagente, concentração de indução de 1 mM), tampão eletrotrotérgico (solução de glicerina a 10%, esterilizada por filtro de 0,22 μm), kit de extração de proteínas (uma marca, contendo tampão de fissura, resina de afinidade, etc.)

2. Principais instrumentos

Gene Pulser X2 dual-wave all-energy electroperforator (com copo rotativo de 0,2 cm, com revestimento condutor de nanoescala para conversão de protocélulas) Centrífuga de alta velocidade por congelação (marca específica, gama de rotações 100-15.000 rpm, precisão de controle de temperatura ±0,5°C) Batedor termostático (marca específica, precisão de rotação ±1 rpm, gama de controle de temperatura 20-60°C) PCR quantitativo por fluorescência (marca específica, para detecção de cópias de plasmódeos recombinantes) Sistema de eletróforese SDS-PAGE (marca específica, para preparação de cola com gradiente de concentração de 10-20%) Espectrofotômetro visível UV (marca específica, para medição de concentração de proteínas)

Construção do sistema de expressão nuclear

3.1 Preparação de plásmidos recombinantes

A sequência codificante de polisacar da proteína central foi cortada por bienzimas NcoI e XhoI e ligada ao veículo pET-28a (+) tratado com a mesma enzima para ser convertida em células sensíveis de E. coli DH5α. Selecionar as monocolônias cultivadas em um meio LB contendo canamicina, extrair o plasmido e obter o plasmido reconstituído corretamente pET-28a-Decorin através da eletroferese e validação de sequência em gel de againe.

3.2 Preparação das células sensoriais

Tome - 80 ° C congelado E. coli BL21 (DE3) vacinado em meio LB 5mL, oscilando a 37 ° C para OD600 = 0,6. Banhe a bactéria em gelo durante 30 minutos, centrifuge a 4 ° C, 5.000 rpm durante 10 minutos para recolher a bactéria, lave 3 vezes com tampão de conversão elétrica pré-refrigerado e, finalmente, ressuspenda em solução de glicerina a 10%, ajustar a concentração celular para 1 x 10 ° C CFU / mL, dividir em 50 μL / tubo, imediatamente para conversão elétrica ou para conservação após congelamento de nitrogênio líquido - 80 ° C.

3.3 Otimização da conversão de perfuração eletrônica

Mesclar 5 μL de plasmídio recombinante (concentração de 1 μg/μL) com 50 μL de células sensíveis para transferir para um copo electrorotativo pré-refrigerado de 0,2 cm. Selecione o modo 'Otimização de protocélulas' no eletroporoador Gene Pulser X2 da Venetian para iniciar o sistema de pré-otimização inteligente:

1. Configuração de parâmetros de sinergia de onda dupla:Para as características da membrana de E. coli, a combinação automática de pulsos de onda quadrada (a tensão é ajustada dinamicamente de acordo com a concentração celular, o valor predefinido inicial é adaptado a 1×10¹Para Para Para Para Para Para Para 1×10¹Para Para Para Para Para as características da membrana de E. coli) com pulsos de onda exponencial é combinada com pulsos de onda exponencial com pulsos de onda exponencial 3 vezes, com um intervalo de pulso de pulso de 1 segundo.

2. Sistema de proteção de arco:A pré-inspeção de resistência é realizada automaticamente antes do processamento para calibrar a saída de pulso em tempo real de acordo com a condutividade do tampão de conversão elétrica, garantindo que a variação de energia seja <1%.

Interação Inteligente:Monitore a forma de onda do pulso em tempo real através de uma tela táctil de 10 polegadas para confirmar que os parâmetros são corretos e que o pedal traseiro dispara o pulso para evitar erros de operação manual.

Adicionar 950 μL de meio LB não resistente imediatamente após a conversão, recuperação oscilante a 37 ° C por 1 hora, tomar 100 μL de comprimidos LB revestidos com cananamicina, contar as colônias após a cultura a 37 ° C por 12 horas e calcular a taxa de conversão (número de conversores / μg de DNA plasmódico).

3.4 Expressão induzida e purificação de proteínas

Selecionar o clone positivo e inocular em 5 ml de meio LB contendo canamicina, oscilar a 37 ° C até OD600 = 0,8 e transferir para 500 ml de meio de fermentação em proporção 1:100. Quando a OD600 atingiu 1,0, adicionar IPTG induzido por 4 horas, 4 ° C, 8000 rpm para coleta centrífuga de bactérios. Fixar as células por ultra-som, após centrifugação, recolher o líquido superior (proteína solúvel) e o precipitado (cobertura), respectivamente. O soro superior foi purificado por estratificação de afinidade Ni-NTA, lavagem de gradiente para obter a proteína de destino, pureza de análise de eletroforese SDS-PAGE, e concentração de proteína foi determinada pelo método Bradford.

3.5 Desenho experimental comparativo

Configurar dois grupos de experimentos controlados: o grupo A usa um perfurador elétrico de onda quadrada tradicional (uma marca) para a conversão, com parâmetros fixos de tensão de 2,5 kV / cm, tempo de pulso de 5ms, pulso único; O grupo B usou o método de conversão química (método CaCl₂) e as restantes condições de cultura foram consistentes com o grupo experimental. Comparar os efeitos de diferentes métodos de conversão na taxa de conversão de plasmídeos recombinantes, expressão de proteínas de destino e atividade.

4. Resultados e discussões

4.1 Análise de eficiência de conversão de perfuração eletrônica

A taxa de conversão do grupo experimental tratado com o Venetian Gene Pulser X2 foi de 8,2 x 109 CFU/μg, um aumento de 41% em comparação com 5,8 x 109 CFU/μg no grupo A e significativamente superior a 1,5 x 106 CFU/μg no grupo B (Figura 1). O número de cópias de plasmódios recombinantes intracelulares após a conversão foi detectado por PCR quantitativa fluorescente com um aumento de 35% no número de cópias de plasmódios monosómicos do grupo experimental em comparação com o grupo A, sugerindo que a tecnologia de sinergia de duas ondas aumentou eficazmente a eficiência da entrega transmembranar de DNA externo. Seu mecanismo principal é que os pulsos de onda quadrada criam rapidamente campos elétricos transmembranares para induzir a formação de poros de membrana, e os pulsos de onda exponencial continuam a otimizar a distribuição de campos elétricos para promover a migração direcionada do DNA plasmídico para o citoplasma, evitando ao mesmo tempo danos irreversíveis à membrana celular causados por ondas quadradas únicas.

4.2 Expressão de proteínas e análise de solvência

A eletroferese SDS-PAGE mostrou que o grupo experimental apresentou uma faixa de proteína de destino clara com um peso molecular de cerca de 38 kDa, consistente com os valores teóricos, quatro horas após a indução. Através da análise de software ImageJ, a proteína solúvel do grupo experimental representou 65% da expressão total, significativamente superior a 42% do grupo A e 30% do grupo B (Figura 2). Os resultados do método de Bradford mostraram que o grupo experimental obteve 21,5 mg de polisacar de núcleo solúvel por litro de cultura, um aumento de 41% em comparação com 15,2 mg no grupo A e quase cinco vezes maior em comparação com 3,8 mg no grupo B. Isso é graças ao sistema de proteção contra o arco 3.0 do Gene Pulser X2, que monitora as flutuações de energia de pulso em tempo real e mantém a probabilidade de faíscas elétricas abaixo de 0,1%, protegendo eficazmente a integridade da membrana das células em estado sensorial e reduzindo a morte celular durante a transformação, mantendo assim uma maior atividade biológica e capacidade de expressão.

4.3 Atividade das proteínas e caracterização estrutural

Detectando a atividade de ligação do polisacar da proteína do núcleo e do colágeno tipo I, o ELISA descobriu que a constante de ligação (Kd) das proteínas purificadas do grupo experimental era de 2,3 x 10-7M, basicamente consistente com a proteína natural (2,0 x 10-7M), enquanto que a atividade foi significativamente reduzida pelos grupos A e B devido à formação de corpos de cobertura (Kd de 5,8 x 10-7M e 8,1 x 10-7M, respectivamente). A análise bicromatográfica círcula mostrou que o teor de alfa-espiral de histonas experimentais era de 32% e o teor de dobragem beta de 28%, e a integridade estrutural secundária era melhor do que o grupo de controle, demonstrando ainda mais a vantagem do eletroporoscópio Venetian em baixa transformação de danos, reduzindo eficazmente a dobragem errada de proteínas devido à resposta ao estresse celular.

Vantagens técnicas e parâmetros-chave

O Gene Pulser X2 da Venete demonstra três vantagens tecnológicas principais neste estudo:

Adaptação precisa de sinergia de ondas duplas: para as propriedades de parede grossa de células protóculas como E. coli, a comutação inteligente de ondas quadradas e ondas exponenciais permite a regulação dinâmica da permeabilidade da membrana, e a resposta paramétrica de milésimos de segundos em forma de onda pulsada garante uma alta estabilidade na eficiência de conversão de lotes diferentes (RSD ≤ 2% entre lotes).

Eficiência do sistema de pré-otimização inteligente: banco de dados integrado de cepas protóculas, como E. coli, sem a necessidade de manipular manualmente a combinação de tensão e pulsos, previsão de parâmetros de novas cepas em 5 minutos, economizando 70% de tempo pré-experimental em comparação com os eletroporosores tradicionais.

Ampliação de aplicações de design modular: design de ranura de eletrodo adaptado para placas de 96 buracos, suporte a triagem de conversão de alto fluxo, combinado com uma interface API aberta para operação on-line com estações de trabalho automatizadas para atender às necessidades de desenvolvimento de processos de produção em massa de proteínas recombinantes.

Os experimentos descobriram uma estreita sinergia entre a intensidade iônica, a concentração celular e os parâmetros de pulso do amortecedor. Quando as concentrações celulares são superiores a 1,5 x 10°CFU/mL, a tensão de pulso deve ser reduzida automaticamente através da função de pré-inspeção de resistência do instrumento para evitar a desigualdade do campo elétrico local causada pela reunião celular; As pequenas mudanças na concentração de glicerina (±1%) podem ser compensadas em tempo real pelo sistema de calibração inteligente do instrumento, garantindo uma eficiência de conversão estável. Esses detalhes refletem a capacidade de controle preciso do Gene Pulser X2 em ambientes experimentais complexos.

6. Perspectivas de aplicação

6.1 Desenvolvimento de processos de produção de proteínas em escala

A tecnologia de otimização da eletroporosação estabelecida neste estudo pode ser aplicada diretamente à produção industrial de polisacárias de proteínas de núcleo, combinando o processo de fermentação de alta densidade com a capacidade de processamento de alto fluxo do eletroporosador Venetian (96 amostras em lotes únicos), promete reduzir os custos de produção em mais de 60%. Seu sistema de proteção contra o arco e a rastreabilidade dos parâmetros fornecem uma garantia confiável para o controle de qualidade na oficina GMP, atendendo aos rigorosos requisitos da produção de proteínas recombinantes na biofarmacêutica.

6.2 Dificuldade de expressão da ruptura da expressão do protonúcleo

Para proteínas complexas ricas em ligações dienxofre e capazes de formar conectores, as propriedades de baixa transformação de danos do Gene Pulser X2 aumentam significativamente os níveis de expressão solúvel. Por exemplo, na expressão de proteínas farmacêuticas como fragmentos de anticorpos, citocinas e outros, um sistema de expressão eficiente pode ser rapidamente estabelecido através de um procedimento pré-definido de "expressão solúvel de células protonucleares", reduzindo o ciclo da clonação de genes para a produção experimental.

6.3 Biologia sintética e expansão da edição genética

A tecnologia de sinergia de duas ondas dos eletroporosores da Venedig demonstra vantagens em áreas como a entrega de protonúcleos do sistema de edição de genes CRISPR-Cas9 e a triagem de alto fluxo de cepas de engenharia metabólica. Sua função de inversão polar suportada é adaptada a materiais de consumo de várias especificações para atender às necessidades de entrega de diferentes tipos de plasmídeos, DNA genômico e até mesmo RNA, tornando-se uma ferramenta central para a pesquisa em biologia sintética.

O electroperforador dual de energia Gene Pulser X2 da Venetian redefiniu a eficiência e a confiabilidade da transformação de células protonucleares com a sua revolucionária tecnologia de sinergia de duas ondas, sistema de proteção inteligente e design de interação digital. O dispositivo passou pela validação de mais de centenas de empresas biofarmacêuticas e laboratórios chave no país, oferecendo serviços gratuitos de otimização de parâmetros exclusivos de cepas e suporte técnico 24 horas por dia, ajudando os pesquisadores a quebrar os gargalos de expressão de proteínas recombinantes e acelerar a transformação de resultados na terapia génica, biofarmacêutica e outras áreas.

Referências

1. Rei vermelho; Wang Guijin; Hao Xiaosha; Construção do sistema de expressão de poliglicogênicos de proteínas do núcleo [J]; Medicina chinesa e clínica; Número 03 de 2006

2. Kim Yuan Chang; Li Jingpeng; Li Oriental; Semana vermelha; Factores que influenciam a expressão genética do protonúcleo do hormônio de liberação de gonadotropina recombinante [J]; Jornal da Academia de Mestres de Xiangtan (edição de ciências naturais); Número 02 de 2006

3. Li Xiaobo; espelhos; Pairy; disputa; Expressão protonuclear da glicoproteína viral B e estabelecimento do método de ELISA [J]; Animais de Experimento e Medicina Comparada; Número 03 de 2009

4. Graças; Chen Mei Qing; Rei coragem; Jiang Junmei; opinião clara; Projeto e prática de técnicas de expressão de protógenos em experimentos abertos de graduação [J]; Revista de Ensino Científico (Medium Edition); Nº 29 de 2020

5. Yang Tao, Yang Li Jun, Feng Qiangjia, Cheng Buliang, Construção e expressão do sistema de expressão protonuclear do fator de crescimento de células hepáticas humanas alfa [J]; Revista Chinesa de Microbiologia e Imunologia; 2004 edição 04

6. Linha; cavalo vermelho; Frostão; Rei Dong; Li Yong; Masonjer; Uma vez Estabelecimento da expressão protonuclear da toxina beta-1 da pod-membrana gasoprodutiva e do método de ELISA indireto de seus anticorpos [J]; Revista de Biologia Chinesa; 12 de 2022

7. Song Tao; Li Weitao; Pengqing; Chenhong; Nissumi; Clonagem e expressão protonuclear do gene da proteína da casca do vírus do feijão do sul [J]; Ciências Agrícolas; Número 13 de 2013

8. Linha de João; Estado-Membro; Dewey; chinês; Li puro; Swipin; Expressão protonuclear de lactefroteina de cabra e preparação de seus anticorpos policlonais [J]; 02 de 2022

9. Wang Zhongxu; Zhou Jing; A camarologia de troca iônica purifica a expressão de protonúcleos ligantes apoptose-induzidos associados ao fator de necrose tumoral [J]; farmacêutica chinesa; Número 10 de 2013

10. Song Shui Mei, A inibição da atividade do fator de crescimento endotelial pelo receptor solúvel do fator de crescimento endotelial do núcleo supergênico de Shucheng [J]; Revista de Medicina Chinesa; Número 03 de 2000