Kit de clonagem rápido de um passo

Condições de armazenamento:-20℃

Composição do produto:Kit de clonagem rápido de um passo

Perfil do produto

Kit de clonagem rápido de um passo

Tecnologia de clonagem contínua baseada no princípio de recombinação, como um método de clonagem de nova geração, não depende de corte enzimático pesado, etapas de conexão, nem precisa de operação de equidade de complemento terminal, com base na recombinação de sequências homônimas de fragmentos de DNA e 15-25 nt no extremo do veículo linear, pode ser clonado fragmento inserido em qualquer lugar do veículo linear, o fundo de autoconexão do veículo é extremamente baixo, é uma técnica de clonagem direcionada de DNA simples, rápida e eficiente.

Kit de clonagem rápido de um passoKits de clonagem sem problemas que permitem a recombinação de um ou mais fragmentos de DNA em uma única reação, com uma taxa positiva superior a 95% em apenas 5 minutos. Fatores auxiliares adicionados ao Kit para melhorar eficazmente a taxa de clonagem positiva; O sistema de reação otimizado é capaz de tolerar, até certo ponto, as impurezas contidas nos produtos de PCR não purificados. A versão atualizada do kit de clonagem sem costura oferece taxas mais altas de positivos e melhor compatibilidade.

Passos experimentais

1. Resumo do processo experimental

2. Preparação do veículo de clonagem linear

Selecionar o local de clonagem adequado para linearizar o veículo, que pode ser feito por corte enzimático ou amplificação de PCR inversa.

① Preparação enzimática

Algumas endocesas restritivas não podem digerir o DNA hiperespiral de forma eficaz e, portanto, podem deixar diferentes quantidades de DNA veículo não cortado, reduzindo a taxa de positivo. Recomenda-se a utilização de enzimas de corte interno rápido LightNingTM para corte enzimático (monoenzimático ou bienzimático) para linearizar o veículo para reduzir o fundo de conversão (clones falsamente positivos obtidos pela conversão do veículo não cortado).

NOTA 1: Os veículos linearizados por corte enzimático não precisam ser desfosforilados, o uso de corte bienzimático é recomendado.

NOTA 2: Após a conclusão do corte enzimático, é recomendado desativar o corte enzimático ou purificar o produto destinado para a reação de recombinação.

Preparação de amplificação de PCR inversa

Para reduzir a introdução de mutações de amplificação, é recomendado o uso de PCR Mix de alta fidelidade para amplificação. Recomenda-se o uso de plasmídeos pré-lineares como modelos para reduzir o efeito dos resíduos de modelos de plasmídeos anelares na taxa de clonagem positiva.

NOTA 1: Quando o produto da PCR não possui uma faixa não específica, é recomendado o uso do Eliminador de Modelo (n.º EG21203) para a digestão de modelos de plasmidos para reações recombinantes; Em vez disso, recomenda-se que o produto de PCR seja usado após purificação.

NOTA 2: Para clonagem em múltiplos segmentos, recomenda-se a utilização após a purificação do produto da PCR.

3. Inserir fragmento PCR desenho de introdutor

A extremidade 5' do precursor de PCR deve conter uma sequência de 15 a 25 nt (recomendado 18 nt) homogênea à extremidade do fragmento adjacente (segmento de inserção ou veículo). Se o veículo for uma extremidade viscosa e a extremidade 3' for saliente, o projeto de introdução deve incluir uma parte saliente; Se a extremidade 5' for saliente, o projeto de introdução pode incluir ou não incluir partes salientes.

Inserir um fragmento de aperto de amplificação positiva:

Sequência homóloga terminal do veículo 5' ascendente + secção enzimática (opcional) + sequência de amplificação positiva genética específica 3'

Inserir um fragmento de amplificação inversa:

3' sequência de amplificação inversa genética específica + localização enzimática (opcional) + sequência homóloga terminal do veículo downstream 5'

NOTA 1: Escolha regiões sem sequências repetitivas e com conteúdo uniforme de GC para a clonação, com recombinação elevada quando o conteúdo de GC é de 40% a 60% na região de 25 nt acima e abaixo do local de clonação do veículo;

NOTA 2: A sequência de conexões do veículo pUC 19 (Ampr) fornecida neste kit é a seguinte:

4. Ampliação de PCR de fragmentos inseridos

Recomenda-se a amplificação com a mistura de PCR de alta fidelidade para reduzir a introdução de mutações de amplificação. Recomenda-se a utilização de produtos de PCR purificados para uma reação de clonagem sem problemas, que podem ser usados ​​diretamente se os produtos de PCR forem identificados como produtos de amplificação específica por eletroferese em gel de aglutinosa, mas o volume de amostragem não deve exceder 20% do volume total da reação.

5. Reação de reorganização

Configurar os seguintes sistemas de reação no banho de água gelada:

A utilização ideal do veículo (ng) = 0,02 × logaritmo da base do veículo, ou seja, 0,03 pmol.

b. Inserir um único segmento com a quantidade ideal de segmento (ng) = 0,04 × logaritmo da base do segmento; Inserir múltiplos segmentos, a quantidade aplicada por segmento zui (ng) = 0,02 × logaritmo da base do segmento.

Nota 1: Se o comprimento do segmento único inserido for maior do que o do suporte, a quantidade do suporte e do segmento inserido deve ser substituída;

NOTA 2: Se o comprimento do segmento de inserção for inferior a 200 bp, o segmento de inserção deve usar cinco vezes a quantidade de veículo;

Nota 3: Se a quantidade calculada de acordo com a fórmula acima excederPara o valor máximo, recomenda-se pressionar diretamenteZuiUtilização máxima;

Nota 4: Os segmentos de veículo são demasiado longos, os segmentos inseridos são demasiado longos ou o número de segmentos é excessivo, e a taxa de clonagem positiva diminui.

Após a preparação do sistema de reação de recombinação, misture os componentes suavemente com uma pistola de pipeta para evitar a geração de bolhas e nunca girar.

Coloque o sistema de reação a 50 ° C, reação de 5 a 60 min.

NOTA 1: Recomenda-se o uso de instrumentos de temperatura mais precisos, como PCR, o tempo de reação insuficiente ou a eficiência de clonagem muito longa será reduzida;

Nota 2: ao inserir 1 a 2 fragmentos, o tempo de reação recomendado é de 5 a 15 minutos; Quando inserir 3 a 5 segmentos, o tempo de reação recomendado é de 15 a 30 minutos;

Nota 3: Quando o esqueleto do veículo é superior a 10 kb ou o fragmento inserido é superior a 4 kb, é recomendado prolongar o tempo de reação para 30 a 60 min.

NOTA 4: Após a conclusão da reação a 50 ℃, recomenda-se a centrifugação instantânea para coletar o líquido reativo no fundo do tubo.

Coloque o tubo de centrifugação do líquido reativo no gelo para resfriar e depois converse ou armazene a -20 ° C.

NOTA 1: O produto recombinante armazenado a -20 ° C é recomendado para uso dentro de 1 semana.

6. Transformação de produtos reorganizados

Tomar 5-10 μl de líquido de reação, adicionar a 100 μl de células sensíveis, aspirar lentamente e misturar, colocar no gelo por 30 min. 42 ° C excitação quente 45 ~ 60 sec, banho de gelo 5 min. Adicione 500 μl de meio SOC ou LB para uma cultura oscilante de 40 a 60 min (200 rpm) a 37 ℃. Aplique a bactéria uniformemente em um comprimido contendo o antibiótico correspondente e inverta-a em uma cultura durante a noite a 37 ℃.

NOTA 1: A taxa final de clonagem positiva de células em diferentes estados de sensibilidade varia, recomenda-se o uso de células em estados de sensibilidade com eficiência de conversão > 108 CFU / μg;

NOTA 2: O número de colônias depende da quantidade e pureza do produto da PCR e do veículo linearizado;

NOTA 3: Os comprimidos de controle positivo geralmente crescem uma grande quantidade de monocolônias brancas, enquanto os comprimidos de controle negativo crescem apenas poucas colônias.

7. Detecção de clonagem positiva

Escolha a única colônia para misturar em 10 μl de ddH2O e, após 10 min de fissão a 95 ℃, tome 1 μl de fissão como modelo para a identificação por PCR da colônia, ou extrair o plasmidro para a identificação por corte enzimático após a vacinação da única colônia em meio resistente durante a noite.

Detecção de clonagem positiva de controle positivo, PCR colonial com precursores genéricos M13F e M13R, identificação enzimática com HindIII e EcoRI.

NOTA 1: Recomenda-se o uso de pelo menos um precursor genérico para evitar resultados falsamente positivos.

NOTA 2: Se necessário, os resultados positivos podem ser sequenciados adicionalmente.

注3： M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R: CAGGAAACAGCTATGAC

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