Kit de meios de cultura de órgãos colonoides humanos à base de modelo Plus (amplificado)

Kit organoide colônico humano mais（Expansão）

Conjunto de meios de cultura de órgãos colonoides humanosMais(Ampliação)

1、 Descrição do produto

Kit de meios de cultura de órgãos colonoides humanos baseados em modelosMais(Ampliação)Kit Organoide Colônico Humano Plus (Expansão) MaisÉ um meio usado para a expansão do órgão colonoide humano, que é composto principalmente de células-tronco do cólon e células progenitoras do cólon. Os colonoides reproduzem as características do epitelio cólon in vivo em termos de auto-renovação e capacidade de diferenciação, estrutura tecidual, tipo celular e função e, portanto, são o modelo in vitro ideal para o estudo do cólon humano.

2、 Informação do produto

3、 Outros reagentes e consumíveis próprios

4、 Instruções de uso do meio de cultura de órgãos colonoides humanos (amplificação)

1、 Depois de receber o meio de cultura orgânica, coloque o meio de cultura em4A geladeira é descongelada.

2、 Após o descongelamento do meio de cultura, misture completamente para cima e para baixo, em um armário de biossegurança ou mesa de trabalho limpa para dividir de acordo com as necessidades diárias, é recomendado dividir em10mL /Tubo.

3、 O meio de cultivo após a partilha deve ser selado e armazenado em-20℃Pode ser usado depois de remover o meio partilhado e colocar o equilíbrio de temperatura ambiente.

5、 Construção e cultura de transmissão de órgãos colonoides humanos

Observação: Estudos que envolvam materiais de tecidos humanos originais devem estar em conformidade com todas as regulamentações institucionais e governamentais relevantes. O consentimento informado de todos os participantes deve ser obtido antes de coletar o material de tecido humano principal.

a) Estabelecimento dos órgãos colonoides humanos primitivos

1、 As amostras de tecido originais devem estar separadas.5 minutosIntroduzir líquido pré-refrigerado para conservação de tecidos vivos (2-8℃No tubo de amostra, a amostra precisa ser coberta por um preservativo de tecido vivo (se a amostra já foi colocada em outro tampão ou meio de cultura, substitua a solução inteira por um preservativo de tecido vivo pré-refrigerado). baixa temperatura)2~8℃Transporte para o laboratório.

2、 Coloque a cola antes do experimento4℃Descongelar no gelo, enquanto remover o meio para colocar o equilíbrio de temperatura ambiente. Os tubos centrífugos, tubos de ensaio ou cabeças de plástico que entram em contato com as células precisam ser lavados com uma lubrificação anti-adesiva de cultura orgânica.

3、 Na mesa de trabalho limpa, a amostra é transferida para um prato de petri para avaliar se o tecido obtido é composto de epitelia. Se houver tecido gorduroso ou muscular, use uma faca ou pinça sob um microscópio anatômico para remover o máximo possível desses componentes não epiteliais. Se não houver gordura ou tecido muscular, continue imediatamente com o próximo passo.

4、 Transferir amostras de tecido para um pré-refrigerado com dupla resistênciaDPBSEm um prato de petri, com a cavidade intestinal virada para cima, usa uma mão para segurar um extremo do tecido intestinal e a outra mão para raspar suavemente a superfície do intestino para remover o muco ou as fezes residuais e, em seguida, colocar o tecido do cólon em um novo bicarbonato.DPBSLimpeza de pratos de Petri2-3Segunda vez. Partir o intestino após a limpeza para cerca de2mm * 5mmTamanho, em seguida, transferir para50 mlTremor intenso no tubo centrífugo.30s(Vibração vertical20Contar uma vez, aproximadamente.1sTrês vezes.)Eliminar, repetir.3Segunda vez.

5、 Digestão: Junte-se30 mldeDPBSAdicionar novamente à solução300 μL 0,5 m EDTAatéEDTAA concentração final é5 milímetros. colocar4℃balançando na cama,80rpmDigestão.20 ~ 30 minutos(Dependendo do volume da amostra, pode ser20Observar a digestão sob o espelho depois de soprar e misturar por minutos, se a estrutura celular completa for observada, a próxima operação pode ser realizada).

6、 Limpeza: Depois de terminar a digestão, deixe para que o intestino sedimente e descarte. Adicionar pré-arrefecimentoDPBSAbate suavemente, descanse e repita.2Depois de removerEDTA。

7、 Recuperação: Junte-se30 mlpré-frio contém0,1% BSAdeDPBSO vortex.10 anosTira-o.100 milímetrosFiltração de filtro, coleta de suspensão de tecido que atravessa o filtro, coleta repetida2Segunda vez.

8、 Coleta:300gforça centrífuga4℃Centrífuga3 minutos。

9、 Absorber o serum epidérmico e ressuspender o precipitado no meio epidérmico de base, retirando a suspensão para a contagem latente.

10、 300gforça centrífuga4℃Centrífuga3 minutosAbsorber o líquido superior, de acordo com as necessidades de cultura para obter a quantidade adequada de precipitação celular para adicionar o gel matriz (>70%e misturar no gelo (Nota: misturar o movimento de soprar deve ser suave, o tabu gerar uma grande quantidade de bolhas, a mistura a temperatura normal precisa ser controlada em15Em segundos), misturado e colocado no gelo. NOTA: A cola de base deve ser mantida no gelo para evitar a sua coagulação. realizar o processo o mais rápido possível. aproximadamente50Um cachorro deve ser vacinado25μLEm cola de base. Não dilua excessivamente a cola de matriz (a proporção de cola de matriz deve ser>70%(Volume da matriz/volume total)), porque isso pode inibir a formação correta de gotas sólidas.

11、 Ponha a suspensão misturada de goma de matriz e células no fundo da placa do orificio da cultura, usando a cabeça da pistola para planejar ligeiramente a suspensão, prestando atenção para evitar que a suspensão entre em contato com a parede lateral da placa do orificio. (Recomendação:96Vacinação da placa3~10μL/buracos,48Vacinação da placa10~20μL/buracos,24Vacinação da placa20~30μL/buracos).

12、 Observação: Uma vez que os orgânicos voltarem a ser suspensos no cola de matriz, faça o plantio o mais rápido possível, pois o cola de matriz pode coagular no tubo de ensaio ou na cabeça de aspiração do pipete.

13、 Coloque a placa de cultivo no37℃e5%CO₂na caixa de cultivo15-25minutos, deixe o gel coagular.

14、 Após a coagulação do gel da matriz, adicionar lentamente o meio orgânico equilibrado à temperatura ambiente ao longo da parede para evitar danificar a estrutura coagulada. (Recomendação:96Adição de placa de furo100 μL/buracos,48Adição de placa de furo250μL/litroburacos,24Adição de placa de furo500μL/buracos). NOTA: Não adicione o meio diretamente ao topo da gota de gel da matriz, pois isso pode danificar a estrutura já coagulada.

15、 Coloque a placa de cultivo em37℃e5%CO₂na caixa de cultivo térmico.

16、 Cada vez2~3Substituir o meio uma vez ao dia, cuidadosamente aspirar o meio do buraco e adicionar o meio orgânico fresco equilibrado à temperatura ambiente.

17、 Monitorar de perto o crescimento dos órgãos.

b) Cultura de transmissão de órgãos colonoides humanos

1、 cultivo de órgãos para o diâmetro de600 milímetrosQuando o tamanho (ou quando a escuridão não aumenta mais), a transmissão orgânica pode ser realizada (cerca de cada geração).1semana). Os seguintes materiais consumíveis em contato com as células devem ser lavados com um líquido lubrificante:

2、 Absorber os meios antigos, adicionar outros meios epiteliais de base volumétrica, raspar suavemente (ou soprar) a goma matriz e a mistura de órgãos com um raspador celular ou uma cabeça de aspiração de pipeta, transferir para1,5 milímetrostubo centrífugo (coleta máximo por tubo)2~3Órgãos porosos, para evitar excesso de volume e baixa eficiência digestiva), soprando5~10Em segundo lugar, separar os orgânicos e a matriz,300gCentrífuga3Um minuto.

3、 Remover a adição de líquido5O volume de líquido digestivo orgânico duplicado do gel matriz e mistura orgânica, depois de soprado e misturado, colocado em37℃Digestão na caixa3Um minuto. Tire a mistura. Pegue.10μLA visão líquida misturada é digerida300 milímetrosGrupo de órgãos esquerdo-direito.

NOTA: Uma etapa de ressuspensão precipitação precisa controlar a força do soprado e o número de vezes, é o tamanho do aglomerado orgânico controlado300 milímetros左右。

4、 Após a digestão, adicione5O meio de base epitelial de volume múltiplo é suavemente soprado e misturado para terminar a reação digestiva, em seguida250gCentrífuga3Um minuto.

5、 Absorber o líquido epitelial e limpar com o meio de base epitelial2Em seguida, para remover os resíduos de líquido digestivo. A segunda limpeza permite a coleta de órganos fundidos no mesmo tubo centrífugo.

6、 Depois da limpeza, as células no precipitado centrífugo são cultivadas para a transmissão, adicionando o gel matriz no precipitado celular (>70%e misturar no gelo (note que o movimento de mistura deve ser suave, evitando a geração de uma grande quantidade de bolhas, a mistura a temperatura normal precisa ser controlada em15Em segundos), misturado e colocado no gelo. Nota: a proporção de diluição do gel de matriz deve ser70%acima para garantir a estabilidade estrutural da cola matriz durante o processo de cultivo.

7、 Ponha a suspensão misturada de goma de matriz e células no fundo da placa do orificio da cultura, usando a cabeça da pistola para planejar ligeiramente a suspensão, prestando atenção para evitar que a suspensão entre em contato com a parede lateral da placa do orificio. (Recomendação:96Vacinação da placa3~10μL/buracos,48Vacinação da placa10~20μL/buracos,24Vacinação da placa20~30μL/buracos). aproximadamente50Vacinação de grupos de órgãos25μLEm cola de base. Observação: para evitar a coagulação da goma de matriz à temperatura ambiente, esta etapa deve ser concluída o mais rápido possível.

8、 Coloque a placa de cultivo no37℃e5%CO₂na caixa de cultivo15-25minutos, deixe o gel coagular.

9、 Após a coagulação do gel da matriz, adicionar lentamente o meio orgânico equilibrado à temperatura ambiente ao longo da parede para evitar danificar a estrutura coagulada. (Recomendação:96Adição de placa de furo100 μL/buracos,48Adição de placa de furo250μL/litroburacos,24Adição de placa de furo500μL/buracos). NOTA: Não adicione o meio diretamente ao topo da gota de gel da matriz, pois isso pode danificar a estrutura já coagulada.

10、 Coloque a placa de cultivo em37℃e5%CO₂na caixa de cultivo térmico.

11、 Cada vez2~3Substituir o meio uma vez ao dia, cuidadosamente aspirar o meio do buraco e adicionar o meio orgânico fresco equilibrado à temperatura ambiente.

12、 Monitore de perto o estado de crescimento dos orgânicos até que os orgânicos precisem realizar a próxima etapa do experimento.

V2.0Edição

Atualização:2025/6/12