PC-12 diferenciação de células de cromofiloma adrenal de rato

PC-12 diferenciação de células de cromofiloma adrenal de rato

PC-12 diferenciação de células de cromofiloma adrenal de ratoÉ uma linha de células de crescimento adjacente derivada do fenocromoblastoma de medula adrenal de rato, com propriedades diferenciáveis ​​induzíveis ​​únicas que podem ser diferenciadas em células neurogênicas sob o efeito de fatores específicos, mantendo a função de secreção de neurotransmissores, tornando-se um modelo in vitro clássico para o estudo do desenvolvimento neurológico, a transmissão de sinalização neurológica e a reparação de danos neurológicos, fornecendo um veículo experimental chave para a pesquisa básica de neurociência e a transformação clínica de doenças neurodegenerativas.

Características biológicas básicas

a) Relação entre a fonte e o tipo de célula

Esta linhagem celular foi separada do tecido do micelocromoscitoma de ratos, e as células do micelocromoscitoma têm a capacidade natural de sintetizar e secretar neurotransmissores catefolamínicos (como noradrenalina, dopamina), com funções altamente semelhantes às células neuroendócrinas do sistema nervoso simpático. As células PC-12 apresentam uma morfologia epitelial no estado não diferenciado, combinando a capacidade de proliferação ilimitada das células tumorais com as propriedades básicas das células neuroendócrinas; E sob as condições de indução pode diferenciar-se em células neurogêneas, formando protuberâncias nervosas, com a estrutura e função parciais dos neurônios, tornando-se um modelo único para conectar as células tumorais com a pesquisa de células nervosas.

2) Características morfológicas e diferenciais

No estado não diferenciado, a célula é poligonal ou oval, quando a parede cresce tem uma distribuição de concentração densa, conexões estreitas entre as células, o citoplasma contém uma pequena quantidade de partículas alcalinófilas (partículas de armazenamento de neurotransmissores), o núcleo é redondo, o núcleo é evidente, a cromatina é distribuída uniformemente, a capacidade de proliferação é forte, o tempo de multiplicação é de aproximadamente 48-72 horas.

Após a diferenciação induzida, a morfologia celular sofre mudanças significativas: sob a ação de fatores como o fator de crescimento neurológico (NGF), em 24-48 horas começam a se estender protuberâncias nervosas finas (de comprimento até 5-10 vezes o diâmetro celular), protuberâncias parciais que se ramificam e se conectam entre si, apresentando uma morfologia neuronal típica; O aumento das partículas alcalífilas na citoplasma, a expressão de enzimas relacionadas à síntese de neurotransmissores (como a tisano-hidroxidase) é regulada e, ao mesmo tempo, marcadores específicos dos neurônios (como a proteína filamentosa NF-200, a proteína associada ao microtubular MAP2) são expressos, mas ainda conservam algumas características celulares do cromofilocitoma (como a secreção de catenolaminas), formando fenótipos únicos de "neurotipos".

Características Moleculares e Funcionais

A nível molecular, as células PC-12 apresentam características moleculares centrais neurorelacionadas: não diferenciadas, expressam receptores do fator de crescimento neurológico (TrkA, p75NTR), fornecendo a base molecular para a indução da diferenciação; Após a diferenciação, a expressão de genes críticos da via de síntese de neurotransmissores (tisano-hidroxidase TH, dopamina beta-hidroxidase DBH) é significativamente melhorada, a secreção de norepiglina e dopamina aumenta 3-5 vezes em relação ao estado não diferenciado, o que pode ser detectado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC); Ao mesmo tempo, as proteínas relacionadas à transmissão de sinalização neural (como a proteína vesícula sinaptica SV2 e a sinapsina Synapsin I) são reguladas para a expressão, com uma certa capacidade de formação de estruturas sinapticas que podem simular a função de transmissão de sinalização dos neurônios.

Funcionalmente, as células PC-12 diferenciadas são sensíveis a substâncias neurotóxicas (como 6-hidroxidopamina, amiloide beta), e após a exposição, ocorrerão manifestações de danos como epilepsia neural e apoptose, altamente alinhadas com o processo patológico da lesão neural, que podem ser usadas para o estudo do mecanismo de danos neurais.

Condições de cultivo e diferenciação in vitro

a) Condições básicas de cultivo

Preferência do meio básicoUsarRPMI-1640 meio de culturaAdicione 10% de soro de cavalo, 5% de soro de vaca fetal (a combinação de soro duplo mantém a proliferação celular e o estado de indiferenciação) e 1% de reagente antibacteriano (para prevenir a contaminação bacteriana). O ambiente de cultivo deve ser rigorosamente mantido em 37 ° C, 5% de CO2, 95% de umidade, a flutuação da concentração de CO2 não excede ± 0,5%, o pH é controlado em 7,2-7,4, a pressão de penetração 280-320mOsm / kg; Temperaturas elevadas (> 39 ° C) podem levar a um aumento da apoptose celular e os parâmetros ambientais devem ser monitorados em tempo real através de sensores de caixa de cultura.

2) Operação de diferenciação

Os fatores indutores comuns sãoFator de Crescimento Neurológico (NGF)As etapas específicas são as seguintes:

Além disso, outros fatores indutores (como o fator neuronutricional de origem cerebral BDNF, forskolina) também podem ser usados, mas a diferenciação induzida pela NGF é o melhor recursivo e o esquema de diferenciação comumente usado é zui.

Congelação e recuperação

No congelamento, o meio de cultura RPMI-1640 com 10% de DMSO, 20% de soro fetal bovino e 10% de soro de cavalo é usado como líquido de congelamento, ajustando a concentração de células não diferenciadas para 1 x 106-2 x 106 células / mL (células diferenciadas são vulneráveis ​​a erupções nervosas, não é recomendado congelar), após a partilha, o método de refrigeração gradiente é usado: colocar a 4 ° C por 30 minutos a -20 ° C e colocar a 1 hora a -80 ° C durante a noite em nitrogênio líquido para conservação a longo prazo.

Durante a recuperação, coloque o tubo de congelamento rapidamente em banho de água de 37 ° C por 1-2 minutos para descongelar, adicione imediatamente a diluição do meio de base pré-aquecida 10 vezes por volume, centrifuge 1.000 x g para remover o DMSO por 5 minutos, e resuspenda para a garrafa de cultura, a taxa de sobrevivência da recuperação geralmente pode ser superior a 75%. 2-3 gerações de cultivo após a recuperação, até que a morfologia celular esteja estável e depois a diferenciação é induzida para evitar que o estresse da recuperação afete a eficiência da diferenciação.

Principais cenários de aplicação experimental

Investigação do desenvolvimento neurológico e mecanismos de diferenciação

As células PC-12 são um modelo central para estudos de neurodiferenciação: os mecanismos moleculares que os fatores neuronutricionais regulam a diferenciação celular podem ser analisados detectando a ativação das vias de sinalização TrkA (por exemplo, vias PI3K/AKT, Ras/MAPK) durante a indução de NGF; Utilizando técnicas de interferência genética (como o siRNA que elimina o gene TrkA) para observar a formação de protuberâncias celulares e mudanças na expressão de marcadores neurônicos, para verificar o papel regulador de genes-chave na diferenciação; Além disso, os efeitos das modificações epigenéticas (por exemplo, metilação de DNA, acetilação de histonas) na expressão de genes associados à neurodiferenciação (por exemplo, TH, MAP2) podem ser estudados para explorar redes epireguladoras do desenvolvimento neurológico.

Construção de modelos e mecanismos de doenças neurodegenerativas

Dependendo da sensibilidade das células pós-diferenciadas a substâncias neurotóxicas, vários modelos in vitro de doenças neurodegenerativas podem ser construídos:

Estes modelos permitem triar potenciais medicamentos neuroprotetores, como antioxidantes e antiinflamatórios, para avaliar seus efeitos reparadores de danos celulares.

Reparação de danos neurológicos e triagem de medicamentos neuronutricionais

Em estudos de reparação de danos neurológicos, o modelo de diferenciação celular PC-12 pode ser usado para avaliar a atividade de drogas neuronutricionais: drogas candidatas (como BDNF, neurojiesidina) podem ser co-cultivadas com células diferenciadas, o comprimento e o número de ramificações dos neurais podem ser observados pelo microscópio, os níveis de expressão de marcadores neurais (como MAP2) podem ser detectados e o efeito da droga no crescimento dos neurais pode ser avaliado; Em modelos de danos neurológicos in vitro (por exemplo, danos induzidos por deficiência de oxigênio e estresse oxidativo), após a intervenção farmacêutica, a taxa de sobrevivência celular, a liberação de lactato deshidrogenase (LDH) (refletindo o grau de dano celular) é detectada, o efeito neuroprotetor do medicamento é validado e a base de pesquisa e desenvolvimento de medicamentos para o tratamento clínico de danos neurológicos.

Precauções para aplicações experimentais