Serviços de preparação de anticorpos policlonais

Serviços de preparação de anticorpos policlonais

Multi-anti processo de preparação geral: * Preparação de antígeno - + imunidade do coelho - → detecção de eficácia e liberação final - + purificação de afinidade de anticorpos - + concentração e conservação de anticorpos.

As etapas experimentais específicas são as seguintes:

Preparação do coelho

Escolha dois coelhos brancos saudáveis da Nova Zelândia (cerca de 2 kg) de tamanho de 6 semanas para adaptá-los ao novo ambiente de vida e estabilizá-los por pelo menos alguns dias para pré-coleta de sangue (para referência negativa)

1.1 Coloque o coelho cuidadosamente em uma prateleira fixa para acalmar o coelho;

1.2 Rase cuidadosamente o cabelo da orelha do coelho para que os vasos sanguíneos sejam claramente visíveis (também não pode ser barbeado);

1.3, se necessário, pode aplicar uma bola de algodão pequena com álcool no local dos vasos sanguíneos para que os vasos sanguíneos se enflamem;

1.4 extrair cerca de 10ml de sangue (cerca de 5ml de soro) da veia do ouvido com uma seringa;

1.5 extrair cuidadosamente a agulha, pressionar adequadamente a ferida para evitar sangramento e, em seguida, desinfetar a ferida com uma bola de algodão alcoólica;

1.6 colocar o sangue coletado em 37 C para 30 min de inativação, depois colocado em 4 'C durante a noite para que ele coagule para liberar o soro;

1.7 irá coagular bem o sangue em 10min de centrifugação em 10000r / min; h) Coleta o soro, ou seja, o soro.

Imunidade do coelho

2.1 injetar dois coelhos antígeno de 1ml, a solução tampão de antígeno deve não conter reagentes químicos prejudiciais para o coelho de cada coelho imunidade inicial 400ug antígeno mais adequado, também pode ser adequadamente reduzido para obter melhores resultados, a imunidade subsequente é de 100ug cada vez.

2.2 misturar completamente 1 m de auxiliar Buddhist com antígeno preparado de 1 m, de cor lactosa; .

2.3 tirar cuidadosamente o coelho da gaiola, tecir o coelho imune em 4 partes (as raízes das costas e coxas são disponíveis), cada parte 250ul, a agulha é inserida em um ângulo de 45 graus na pele de 1-2cm, permanecer alguns segundos após a injeção para evitar a saída do antígeno.

2.4 O ciclo de doença do coelho é de 20 dias, com a coleta de sangue após a imunização de 7 a 10 dias (incluindo a coleta de sangue no meio do teste e a hemorragia final), com uma imunização total de 4 a 5 vezes.

3. Teste de Eficiência

2 referências negativas para pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré-pré- Referência positiva para o anterior

Soro positivo

3.2 adicionar 100ul, 1ug/m de antígeno por gota em uma placa de 96 poços durante a noite a 49 ° C, também pode ser incubada por 2 horas a 37 ° C.

3.3 derramar a solução de antígeno, adicionar 200u de líquido fechado por poço, incubar por 49C durante a noite ou 379C por 2 horas.

3.4 derramar o líquido fechado, no papel de absorção de água para secar o líquido residual, lavar a placa com líquido de lavagem três vezes por vez para secar o líquido residual, para colocar por algum tempo, 37 ° C secar e fechar com um bolso fechado melhor do que 20 ° C armazenar.

3.5 pegar o pacote é uma boa placa de 96 buracos,第---Os poros são adicionados com 100ul de líquido de referência negativo, o segundo poro é adicionado com 100ul de líquido de referência positivo, o terceiro poro é adicionado com 1:500 de anti-soro a ser testado, e os poros subsequentes são diluídos em vez desta base e incubados a 37 ° C por 1 hora.

3.6 derramar o líquido, lavar a placa três vezes com líquido de lavagem e secar. Adicione 100u de lgG anti-coelho de camundongos marcados por HRP (diluição 1: 2000) a cada poço e incube durante 45 minutos a 37 ° C.

3.7 derramar o líquido, lavar a placa três vezes com líquido de lavagem e secar. Adicione 100 u de substrato TMB (Sigma Single Component TMB) a 37 ° C por cada buraco durante 5-20 minutos (o tempo de coloração é determinado de acordo com a cor escura).

3.8 Adicione 50u de líquido terminante (2N H2SO4) a cada buraco para ler o valor de absorção de luz no comprimento de onda de 450 nm no calibre enzimático.

A hemorragia final do coelho pode ser realizada após o teste de eficácia dos anticorpos atingir mais de 1 milhão.

Purificação de anticorpos

Afinidade dos anticorpos - preparação da coluna de afinidade

4.1 Pesando 1 mg de gel de againe de CNBr-Sepherose 4B é adicionado a 2 mmol / L de ácido clorhídrico, 4 'C durante a noite para torná-lo completamente dissolvido, para obter 3 m de gel dissolvido.

4.2 Transferir o gel para a coluna de purificação e lavar o meio 3 vezes com cerca de 20 ml de 2 mmol / L de ácido clorhídrico.

4.3 lavar o meio com tampão acoplado - vezes, porque o grupo ativado é facilmente hidrolizado no pH do tampão acoplado, então esta etapaConcluído em poucos minutos.

4.4 Adicionar 5-10mg de antígeno dissolvido em tampão acoplado 5ml ao gel

4,5 misturar suavemente a temperatura ambiente, agitando por 2-4 horas, ou 4 'C durante a noite, tomando uma pequena quantidade de solução para teste após o final desta etapa, se necessário para medir a eficiência de ligação. Lave o meio uma vez com 20 ml de tampão acoplado.

4.6 Adicionar 15 mL de solução de 1% BSA para incubar a temperatura ambiente durante 2 horas ou 4 'C durante a noite.

4.7 lavar o meio com tampão de fosfato mais de 3 vezes, cada vez mais de 15m h.

4.8 A fase de solidificação do antígeno é concluída e pode ser usada para purificação.

4.9 Se não for usado imediatamente ou após a utilização, confinar com 20% de etanol.

Purificação e conservação do anti-soro

5.1 anti-soro diluído em volume com PBS e outros, 5.000-10.000 / min por centrifugação durante 15 minutos para remover o soro.

5.2 Limpe a coluna de afinidade de antígeno com 10 vezes o volume de PBS para equilibrar a coluna.

5.3 Adicione um anti-soro bem diluído de 10m a uma coluna bem equilibrada.

5.4 Misturar suavemente e agitar a temperatura ambiente por 2-4 horas, ou 4 'C durante a noite

5.5 Limpe a coluna de antígeno com 10 vezes o volume de PBS para lavar as heteroproteínas ligadas à coluna

5.6 lavar a coluna com um volume duplo de anticorpos para obter anticorpos específicos

5.7 pilar de equilíbrio com 10 vezes o volume PBS

5.8 A coluna é selada com 20% de álcool e conservada em 4'C.

Depois que os anticorpos foram lavados, após a concentração de sacarose ou polietilenol, a sal foi eliminada por diálise em PBS, usando um espectrofotômetro visível ultravioleta no comprimento de onda de 280nm para determinar o valor de OD do anticorpo, o valor de OD obtido dividido por 1,35 é a concentração do anticorpo medido, adicionando 40-50% de glicerina colocada em 20 ^ C para conservação a longo prazo.

Serviço em parte experimental