PCR quantitativa por fluorescência em tempo real

1. Visão geral dos serviços

PCR quantitativa por fluorescência em tempo realQuantitative Real-time PCR (qPCR) refere-se ao método de adicionar grupos fluorescentes ao sistema de amplificação de PCR, monitorar todo o processo de PCR em tempo real usando a acumulação de sinais fluorescentes e, finalmente, analisar quantitativamente modelos desconhecidos através de curvas padrão. Como a tecnologia "padrão ouro" na pesquisa de biologia molecular, a qPCR, por sua sensibilidade, especificidade e precisão, tornou-se uma ferramenta para análise da expressão genética, detecção de patógenos e estudo de variações genéticas.

Contamos com a plataforma de teste PCR para fornecerExtração de ácido nucleico de amostras, retrotranscrição, qPCR para análise de dadosServiço técnico único. Quer você precise detectar níveis de expressão de mRNA, miRNA, lncRNA ou realizar análises de variação do número de cópias de DNA (CNV), podemos fornecer dados de alta qualidade que atendam aos padrões.

2. Princípios e métodos técnicos

Oferecemos duas estratégias de teste principais para atender a diferentes necessidades experimentais:

• Método de coloração SYBR Green I:

• Princípio:O corante SYBR Green I pode ser especificamente ligado a pequenas fossas de DNA de dupla cadeia, aumentando o sinal fluorescente após a ligação. À medida que o produto da PCR aumenta, o sinal fluorescente aumenta sincronicamente.

• Aplicável:Triagem inicial de diferenças de expressão genética, teste de amostras em grande escala, projetos sensíveis ao custo. Nós trabalhamos com a análise da curva de fusão para garantir a uniformidade do produto amplificado.

• Método de sondagem TaqMan:

• Princípio:Usando sondas específicas projetadas para a sequência alvo (grupo de relatório de fluorescência marcado em 5', grupo de extinção marcado em 3'). A sonda não tem fluorescência quando está completa, e a hidrolise da enzima Taq durante a amplificação separa o grupo fluorescente e emite fluorescência.

• Aplicável:Alta especificidade requer experimentos, PCR múltipla, tipificação de SNP e detecção de amostras em traços.

Conteúdo do serviço e todo o processo

Seguimos rigorosamente os procedimentos operacionais padronizados (SOP) para garantir que cada passo seja controlado com precisão:

Fase 1: Desenho e otimização experimental

• Projeto da sonda:Desenhar protérios trans-endogênicos para o gene alvo, evitando interferências com a poluição do DNA do genoma; Triagem de genes endossens (genes domésticos, como GAPDH, ACTB, 18S rRNA, etc.).

• Verificação pré-experimental:Verificação da especificidade do precursor por meio de PCR comum e eletróforese em gel de aglutinosa para otimizar a temperatura de cozimento.

Fase 2: Processamento de amostras

• Extração de ácido nucleico:Para diferentes tipos de amostras (células, tecidos, sangue, exossomas, etc.), utilize kits especializados para extrair RNA total ou DNA de alta qualidade, para testes de concentração e pureza (OD260/280) e avaliação de integridade.

• Transcrição reversa (síntese de cDNA):Oligo (dT) ou precursores aleatórios para mRNA; Para garantir uma eficiência de transcrição uniforme, use o método de introdução ou adição de anel de tronco para miRNA.

Fase 3: Teste de embarque

• Construção do sistema:Configure o sistema de reação qPCR de alta fidelidade, configurando pelo menos 3 duplicados técnicos para eliminar erros de amostragem.

• Execução do programa:Capture sinais fluorescentes em tempo real para gerar curvas de amplificação.

Fase 4: Análise de dados

• Quantidade relativa:Adopção2−ΔΔCtO método calculou a diferença de expressão genética no grupo experimental em relação ao grupo de controle.

  
  

• Quantificação:Construir padrões plasmídicos, desenhar curvas padrão e calcular o número preciso de cópias do gene de destino na amostra.

  
  

4. Nossas principais vantagens

1. Plataforma de hardware:O PCR quantitativo principal, a diferença de porosidade é extremamente pequena e a estabilidade dos dados é alta.

2. Sistema de controle rigoroso:Seguir Internacional MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments） Guia. Monitore rigorosamente a eficiência de amplificação (90%-110%) e a relação linear (R² > 0,99) para evitar falsos positivos / falsos negativos.

3. Tratamento de amostras complexas:Uma vasta experiência no processamento de amostras de FFPE, microtecidos, exossomas e sangue inteiro para remover eficazmente inibidores de PCR.

4. Entrega de dados profissionais:Não só os valores de Ct originais são fornecidos, mas também os gráficos de amplificação, os gráficos de fusão, os gráficos de coluna / gráficos de calor da expressão relativa e a geração de relatórios completos com materiais e métodos experimentais detalhados para atender diretamente aos requisitos de publicação do SCI.

5. Aplicações

• Análise do nível de expressão genética:Validação da expressão diferencial de mRNA, lncRNA e circRNA em diferentes condições de tratamento ou modelos de doença (validação por qPCR após seqüência de RNA).

• Teste de miRNA:Estudo de regulação da expressão de microRNA.

• Variação do número de cópias do DNA (CNV):Detecção de amplificação ou ausência de genes tumorais, identificação do número de cópias geneticamente modificadas.

• Verificação SNP:Identificação genótipa de locais de polimorfismo de um único nucleótido.

• Teste de microbiologia patogênica:Determinação da carga viral, análise qualitativa e quantitativa de bactérias.

• ChIP-qPCR:A validação do enriquecimento de fragmentos de DNA após a imunodecipitação da cromatina, estudando a interação proteína-DNA.

6. Requisitos de amostragem e critérios de entrega

• Recomendação de amostragem:

• Células: Depositação celular >

• 1*10^6， O PBS congela após a lavagem.

• Organização:Tejido animal > 50 mg, tecido vegetal > 100 mg, congelamento de nitrogênio líquido ou conservação RNAlater

• Sangue:O sangue inteiro requer tratamento anticoagulante ou fornecimento direto de soro/plasma isolado.

• RNA e DNA:Concentração > 50ng / μL, volume total > 1μg, transporte de gelo seco.

• Entrega:Relatório completo do experimento (com as etapas do experimento, informações sobre o reagente), arquivos de dados brutos (.eds/.xls), gráficos de resultados da análise de dados (tabelas estatísticas do Excel e imagens de alta definição).