células embrionárias de salmão; CHSE-214

Nome do produto:células embrionárias de salmão; CHSE-214

Categoria de Produto: Outras Linhas Celulares

Características de crescimento: Crescimento de parede

Sistema de cultura: MEM + 10% FBS, 28 ° ou 21 ° cultura

Morfologia celular: epitelial

Especificações: garrafa de cultura 1 x 10 ^ 6cells / T25

Número de produto: CS-C2905

Como congelar as células:
Método de conservação congelada 1: O tubo de congelamento é colocado em 4 ° C por 30 a 60 minutos (-20 ° C por 30 minutos *) -80 ° C por 16 a 18 horas (ou durante a noite) no tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
Método de conservação congelada 2: O tubo de congelamento é colocado no refrigerador programável configurado para baixar 1-3 ° C a -80 ° C por minuto, e depois colocado no tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. * -20 ° C não deve exceder 1 hora para evitar que os cristais de gelo sejam grandes demais, causando a morte de células em massa, você também pode pular esta etapa para colocar diretamente no frigorífico de -80 ° C, mas a taxa de sobrevivência é ligeiramente reduzida.

O tecido epidérmico é formado pela camada extraembrionária durante o período embrionário, com efeitos anti-atrito e anti-dano. A tecnologia da empresa fornece RNA total de alta qualidade, cadeias de cDNA preparadas por PCR, proteínas e seus subcomponentes de tecidos epidérmicos fetais de ratos frescos ou congelados. Todos os produtos passam por um rigoroso processo de QA / QC antes do envio para garantir sua qualidade. Estes produtos podem ser usados ​​diretamente para a clonagem de genes, análise de mapas de expressão e estudos em vários experimentos de biologia molecular.
Preparação total de RNA:Isole o RNA com o reagente Trizol do Qiagen RNeasy Kit e purifique-o com o Qiagen RNA Clean Kit. As amostras totais de RNA fornecidas pela empresa incluem a concentração total da amostra de RNA, o conteúdo total, as fotografias de eletrofórese, os resultados da determinação do valor de OD, etc.

Preparação do cDNA:O RNA total purificado é sintetizado para a cadeia de cDNA e reverso-transcrito em um sistema de reação total de 50 ul, que inclui a reverso-transcritase MMLV e iniciadores aleatórios e 10 mg de RNA total. Terminar a reação RT após 10 min de reação a 68 ℃. Usando 1x RT Buffer para transportar cDNA, 1 ul de cDNA é suficiente para uma resposta de PCR. Todos os produtos cDNA passam por uma análise rigorosa de QA / QC antes do envio do pedido para garantir a qualidade do produto.

Preparação de proteínas:Utilização de modelos melhorados RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin) Preparar a solução de tecido epidérmico fetal de rato, remover os fragmentos de tecido por centrifugação, medir a concentração de proteína através do kit de teste de proteína Bio-Rad, diluir a proteína histológica com tampão de proteína não redutora (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0,002% Bromphenol Blue) adicionando 5% de beta-tertial etanol e PMSF, -80 graus.

Aplicações potenciais: clonagem por PCR de genes conhecidos; <2> corte seletivo de mRNA; Clonagem de genes e sequenciamento de alvos; <4>Western and Northern Blot； <5> Detecção de proteínas e proteômica; <6> Mapa de pesquisa e expressão de chips.

Tratamento celular:

1) Células de recuperação: coloque rapidamente o tubo de congelamento contendo 1 ml de suspensão celular em um banho de água de 37 ° C (a superfície da água deve estar abaixo da tampa do tubo de congelamento) e agite para descongelar, mover-se para um tubo centrífugo de 15 ml pré-preparado contendo 4 ml de meio de cultura e misturar uniformemente. Centrifugar em 1000RPM por 4 minutos, descartar o líquido e adicionar 1mL de meio para soprar bem. Em seguida, toda a suspensão celular é transferida para a cultura durante a noite em uma garrafa com meio de cultura de 5 ml. No dia seguinte, troce o líquido e verifique a densidade celular.
2) Transmissão celular: se a densidade celular chegar a 80% -90%, a cultura de transmissão pode ser realizada.
Para células suspensas, a transmissão pode ser feita com referência aos seguintes métodos:
Método 1: coletar as células, 1000 RPM, centrifugar em condições de temperatura normal por 5 minutos, descartar o líquido superior, adicionar 1-2 ml de líquido de cultura depois de soprar bem, dividir a suspensão celular na proporção de 1: 2 a 1: 5 em um novo prato ou garrafa com 8 ml de meio de cultura.
Método 2: você pode escolher a metade do método de troca de líquido, depois de descartar metade do meio de cultura, suspender as células restantes e dividir a suspensão celular na proporção de 1: 2 a 1: 3 em um novo prato ou garrafa com meio de cultura de 8 ml.
3) congelamento celular: quando as células estão em bom estado de crescimento, as células podem ser congeladas. Quando as células em suspensão são congeladas, as células devem ser coletadas, 1000RPM, centrifugação em condições de temperatura normal por 5 minutos, pequenas quantidades de líquido líquido (para evitar que as células sejam absorvidas), adicionar parte do meio fresco, depois de soprar uniformemente, adicionar ao tubo de congelamento, adicionar 10% de DMSO no tubo de congelamento para congelamento. congelamento de meios de cultura
Os meios de cultura de congelamento recomendados devem ser usados ​​para congelar as células. Os meios congelados devem conter refrigerantes como DMSO ou glicerina. Também é possível usar meios de congelação * especialmente preparados.
1) O meio de congelamento celular é um meio de congelamento pronto para uso * para células de mamíferos, cuja proporção de soro fetal bovino e soro bovino é otimizada para melhorar a vitalidade celular e o efeito de recuperação celular após o descongelamento.
2) O meio de congelamento é um meio de congelamento estéril, sem proteína, com 10% de DMSO, definido por composição química, adequado para o congelamento de várias células-tronco e células progenitas (exceto melanócitos).
Processo operacional:
1.1 Principais reagentes e instrumentos: microscópio de fase inversa (Olympus IMT-413 do Japão), incubadora de CO2 (Yamato IT-61 do Japão).
1.2 Transferência e congelamento de culturas de recuperação de células hek-293:
1.2.1 Cultura de recuperação de células Tire o tubo de congelamento do tanque de nitrogênio líquido, coloque-o imediatamente em um banho de água de 37 ° C e agite constantemente para derretê-lo rapidamente. Retire o tubo de congelamento de células dissolvidas, depois de desinfetar com álcool, aspirar o líquido de congelamento de células solúveis, adicionar o líquido de cultura pré-carregado (37 ° C pré-aquecido, 8 a 10 vezes o volume) dentro do tubo centrífugo, misturar ligeiramente e, em seguida, 1000 rpm 5min, remover a limpeza superior, adicionar a quantidade adequada de líquido de cultura, soprar em suspensão celular, vacinar em uma garrafa de cultura de 25 cm2 com densidade de 1 x 105 / ml, cultivar a 37 ° C, 5% de CO2 e umidade saturada.
1.2.2 Transferência celular Cultura original de células hek-293 48h troca de fluido 1 vez, a célula cresce até 60% ~ 70% quando a fusão, com 0,25% digerir 1 ~ 2 min, a garrafa de cultivo e depois bater suavemente com a palma da mão para que as células removam a parede, suspensão, dispersão, para que as células se espalhem ainda mais, a suspensão celular pode ser usada para soprar suavemente várias vezes, obter a suspensão celular e, em seguida, adicionar a quantidade multiplicada de meio de cultivo, misturar suavemente, mistura de distribuição de tubo, transmissão de células amplificadas.
1.3 Observação da morfologia celular Observar e registrar o crescimento e as características morfológicas das células sob um microscópio invertido.
1.4 Contagem de células Digerir as células de forma regular, até que as células se arredondem, desmurem e flutuam, adicionar uma pequena quantidade de meio de centrifugação, e depois usar pbs para ressuspender e soprar para fazer uma suspensão celular. Adicione uma suspensão de células em um lado do slide da placa de contagem de células, observe o número de células quadradas quadrangulares da placa de contagem com uma lente de 10 x e calcule o número de células de acordo com a fórmula. Número de células / ml de líquido primário = (soma do número de células quadrados / 4) × 104.
1,5 taxa de adesão das células Células do período de crescimento exponencial, a 0,25% digerida em uma suspensão de células individuais, após a contagem de vacinação em 12 garrafas de cultura de 25 cm2, retirar aleatoriamente 3 garrafas de células a cada duas horas, absorver o meio de cultura e as células não adesivas, adicionar a digestão pandigestase, contar as células adesivas, tomar a média, de acordo com a fórmula: taxa de adesão (%) = (número de células adesivas / número de células vacinadas) × 100%, a taxa de adesão é calculada.
1.6 Curva de crescimento Tome células do período de crescimento exponencial para fazer uma suspensão de célula única com a digestão, a 1 x 104 / poço em uma placa de 24 poços, adicionando 1 ml de meio para cada poço. Tome 3 buracos aleatórios por dia, conte o número de células por buraco e calcule a média. Contagem contínua 10d, desenhando a curva de crescimento celular.

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Ácido oleanólico 17β-hidroxi-4-androeno-3--17-éster
Extrato de tecido epidérmico fetal de ratoLipase humana A2 elisa 试盒≥4190% conforme determinado pela SDS-PAGE 2,5-二对苯二

≥4191% em caixa de ensaio da mutase de glicose humana, conforme determinado pela SDS-PAGE 4-cloro-6-xil-5-fluorpirimidina

≥4192% conforme determinado pelo SDS-PAGE L-(+)-amígdala

Adenosina ativada proteína quinase humana elisa caixa de ensaio ≥4194% como determinado por SDS-PAGE N,N'-(4,4'-subdifenil)bimalaemida

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Fator nuclear humano κB inibidor proteína α elisa caixa de ensaio ≥4196% como determinado pelo SDS-PAGE

≥4197% conforme determinado pelo SDS-PAGE 2,4,5-trietiltiazol

≥4198% como determinado pelo SDS-PAGE 6-hidroxi-2-naftalsulfônio de sódio

≥4199% como determinado pelo SDS-PAGE 4-fluoro-3-fenaldeido

Linfocito因o humano elisa caixa de ensaio ≥4200% como determinado pelo SDS-PAGE 2,3-dipiridina

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Complexo de Antígeno Linfocito Humano 6 Plasma A Elisa Kit ≥4202% como determinado pelo SDS-PAGE

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Antigênio ligado à função de linfocitos humanos 2 elisa caixa de ensaio ≥4204% como determinado pelo SDS-PAGE

Relatório experimental:
Separação e cultivo:
1, sob condições estériles, remova o tecido atrial de ratos SD de idade 1-3d e, em seguida, use PBS para limpar este bloco de tecido duas vezes, então será de aproximadamente 1 mm3 de tamanho;
2, adicionar 4 ml de digestão enzimática (0,1% 0,1% de colágenase tipo I) ao bloco de tecido, misturar 10s, colocar a digestão em condições de 37 ° C por 10 minutos, em seguida, soprar com um tubo de gota para fazer uma suspensão unicelular, precipitar naturalmente e recolher a limpeza superior, colocar a 4 ° C após a terminação da digestão com um meio que contém 10% de FBS;
3, o tecido restante adicionar 3-4mL de líquido digestivo enzimático, misturar 10s, colocar 37 ° C após a digestão 10 min, de acordo com o método acima recolher o limpo e terminar a digestão após a colocação 4 ° C, repetir esta etapa 2-3 vezes até que o tecido * é digerido;
4, filtre a digestão celular com uma tela de aço inoxidável de 200 meshes, centrífuga de 1200r / min para 10min, descarte a limpeza superior, as células de precipitação são misturadas com um meio de cultura que contém 10% de FBS DMEM / F12, vacinadas em garrafas de cultura de 25 cm2, colocadas em 37 ° C, 5% de CO2 em uma caixa de cultura;
5, após a diferença de adesão à parede 1h, aspirar o meio de cultura, de acordo com a necessidade experimental de vacinação na placa de 6 buracos para continuar a cultivar;
Identificação de imunofluorescência:
1, espera que as células do músculo atrial cresçam até 80% de fusão, descartar o meio de cultura, lavar as células com PBS de crescimento térmico 2 vezes, cada vez por 10 minutos, e, em seguida, fixar as células com poliformaldeído de 4% a temperatura ambiente por 15 minutos;
2, PBS lavar as células 2 vezes, cada vez por 10 min, em seguida, em condições de 4 ° C, com 0,1% Triton X-100 permeabilidade por 15 min;
3, PBS lavar as células 2 vezes, cada vez por 10min, em seguida, em condições de temperatura ambiente, com 4% BSA para fechar as células por 30min;
Dilue a alfa-actina em proporção de 1: 100 e coloque-a no frigorífico de 4 ° C para incubar as células durante a noite;
5, PBS lavar as células 3 vezes, 10min cada vez, diluir a resistência anti-alfa-actina em proporção de 1: 150, colocar 1h em condições de 37 ° C;
Lave com PBS 3 vezes, cada vez por 10 minutos, depois observe a imagem sob o microscópio fluorescente invertido e tire fotos.