TRzol LS (Reagente de extração de RNA de amostra líquida)

Propriedades do produto:

Condições de armazenamento:

O TRzol LS permanece estável a temperatura ambiente por 12 meses. No entanto, para obter os melhores resultados, recomendamos conservar em um ambiente de 2-8 ° C.

Notas importantes:

Os venenos que entram em contato com a pele ou são engolidos inadvertidamente podem causar queimaduras. Limpe imediatamente após entrar em contacto com a pele com uma grande quantidade de detergente e água limpa. Se sentir desconforto, consulte um médico e procure o tratamento correto com outros ingredientes.

Introdução do produto:

O reagente TRzol LS é um reagente que extrai o RNA total diretamente de uma célula ou tecido. Mantém a integridade do RNA ao quebrar e dissolver as células. Após a adição de cloroformo, a amostra é centrifugada e dividida em camadas hídricas, intermediárias e orgânicas. O RNA está presente na camada de água. Após a coleta da amostra acima, o RNA pode ser recuperado através da precipitação de isopropanol. Seja para pessoas, animais, plantas ou bactérias, este método tem um melhor efeito de separação em pequenas e grandes quantidades de tecidos e células. A simplicidade de operação do reagente TRzol LS permite

processar várias amostras. Todas as operações podem ser realizadas em uma hora. O RNA total extraído com TRzol evita a contaminação do DNA e das proteínas e pode ser usado para análise de impressões de RNA, hibridação de manchas, triagem poly(A)+, tradução in vitro, análise de proteção enzimática de RNA e clonagem molecular. Se for usado para PCR, quando dois precursores estão localizados dentro de um único exônio, é recomendado usar a DNase I amplificadora para processar o RNA total extraído.

Atenção:

Isolar amostras de RNA de pequenas quantidades de tecido (1-10 mg) ou células (10 2-10 4 peças): adicionar 800 µl de TRzol ao tecido ou células. Depois que a amostra for fissurada, adicionar cloroformo e realizar a extração na etapa 2. Antes de precipitar o RNA com isopropanol, adicione 5 a 10 μg de glicogênio sem enzima de RNA como veículo para a camada da amostra. Para reduzir a viscosidade, use a seringa 26 para cortar o DNA genômico duas vezes antes de adicionar cloroformo. O glicogênio permanece na amostra e é analisado com o RNA. Não inibe a síntese da primeira cadeia da reação de retrotranscrição nem a PCR até a concentração de 4 mg/ml.

Após homogenização e antes da adição de cloroformo, a amostra pode ser conservada a -60 ° C ou -70 ° C por pelo menos um mês. A precipitação de RNA dissolvida em 75% de etanol pode ser conservada por pelo menos uma semana a 2-8 ° C e por pelo menos um ano a -5-20 ° C.

Usar luvas e protetores oculares para extrair RNA com TRzol LS. Evite o contato com a pele e roupas. Operação concluída no armário de ventilação química. Evite a respiração. Sem exceção, a temperatura ambiente é mantida entre 15 e 30°C.

Reagentes próprios:

Cloroformo, isopropanol, etanol a 75% (preparação de água livre de RNase), água livre de RNase (adicionar água a garrafas de vidro sem enzima de RNA, adicionar DEPC a 0,1% (V / V). Coloque durante a noite e esterilize sob alta pressão). Solução SDS a 0,5% (preparação de água livre de RNase) (opcional).

Passos operacionais:

1. pré-tratamento da amostra a. líquido biológico Adicione 0,75 ml de TRzol LS a cada 0,25 ml de amostra líquida (soro, plasma, etc.) e soprar a amostra líquida várias vezes com uma pistola de amostragem para ajudar a fissurar as células na amostra. Adicione pelo menos 0,75 ml de TRzol LS a cada 5-10 x 10 6 células. Para amostras com alto teor de poluentes, como amostras de sangue inteiro, a extração pode ser iniciada após diluição dupla com água esterilizada na proporção 1: 1. A relação final de volume para TRzol LS e amostras líquidas é sempre 3: 1. Mesure a amostra de tecido com vidro ou amortiguador forte, adicionando 0,75 ml de TRzol LS a cada 50 ~ 100 mg de tecido ou 0,25 ml de suspensão de tecido. Geralmente, o volume de tecido de 50 a 100 mg deve ser menor que 0,25 ml, se o volume da amostra de tecido for menor que 0,25 ml, adicione água de esterilização para ajustar o volume da amostra de tecido para 0,25 ml para garantir que a proporção de volume seja 3: 1. c. Células de crescimento de camada única Adicione 0,3 ml-0,4 ml de células dissolvidas TRzol LS diretamente para uma placa de cultivo com diâmetro de 3,5 cm, soprando com uma pistola de amostragem para ajudar a separar as células completamente. A quantidade de TRzol LS necessária é determinada com base na área da placa em vez do número de células (por 10 cm2 mais 0,3-0,4 ml). Não é necessário adicionar água ao fissado, porque o líquido residual ligado à placa de cultura diluiu o TRzol LS adequadamente. d. Células em suspensão de crescimento As células são precipitadas por centrifugação. Soltar repetidamente uma pipeta no reagente TRzol LS para dividir as células. Por 5-10 x 10 6 células animais, plantas ou células de levedura ou por 1 x 10 7 bactérias adicionar 0,75 ml de TRzol LS. Ajuste o volume da amostra para 0,25 ml com água esterilizada como na etapa b. A lavagem das células deve ser evitada antes da adição de TRzol LS, pois isso aumentará a probabilidade de degradação do mRNA. A quebra de certas leveduras e bactérias pode exigir o uso de um amortiguador. 2. Fase de separação A amostra homogêmica é incubada em 5 min a 15-30 ° C para que a nucleoproteína se decomponga. Adicione 0,2 ml de cloroformo a cada 0,75 ml de TRzol LS. Tape a tampa do tubo de amostra, agite o tubo com força com a mão por 15 segundos e incube-o a temperatura ambiente por 2 a 15 min. Congelar a alta velocidade de centrífuga a 2 ~ 8 ° C com uma força centrífuga não superior a 12.000 × g por 15 min. A mistura pós-centrifugação é dividida em três camadas: camada inferior - cloroforme, camada média, camada superior de amostra de água incolor. O RNA está presente na amostra de água sem exceção. A capacidade da amostra de água é de aproximadamente 70% da capacidade do TRzol LS adicionado.

Depositação de RNA Transferir a camada da amostra para um tubo limpo, se desejar separar DNA e proteínas, a camada orgânica e a camada intermediária também devem ser mantidas. O RNA é precipitado misturando a amostra com isopropanol. Cada 0,75 ml de TRzol LS corresponde a 0,5 ml de isopropanol. A amostra misturada é incubada em 15-30 ° C por 10 min e congelada por centrifugação a alta velocidade a 2 ~ 8 ° C por 10 min com uma força centrífuga que não exceda 12.000 x g. A precipitação de RNA geralmente não é visível antes da centrifugação e, após a centrifugação, a precipitação forma uma placa gelatinosa ligada à parede do tubo de ensaio e ao fundo do tubo.

Lavagem do RNA Remover a suspensão superior. Lave a precipitação de RNA uma vez com 75% de etanol (preparação de água livre de RNase), adicionando pelo menos 1 ml de etanol de 75% a cada 0,75 ml de TRzol LS. A amostra é misturada com oscilação de vortex e congelada a uma alta velocidade de centrífuga de não mais de 7.500 × g a 2 ~ 8 ° C por 5 min.

Resolver o RNA A temperatura ambiente é simples para secar a precipitação do RNA, não centrifugar o RNA em um tubo de vácuo. É particularmente importante que a precipitação de RNA não seja seca, o que diminui drasticamente a sua solvência. As amostras de RNA parcialmente dissolvidas tiveram uma relação OD260/OD280 < 1,6. Remova água livre de RNase ou solução de SDS a 0,5% (preparação de água livre de RNase) várias vezes em uma pipeta para dissolver o RNA (evite o uso de SDS se o RNA for usado posteriormente para reações de corte enzimático). O RNA também pode ser dissolvido em formalimida 100% (removendo íons) e conservado a -70°C.

Passos básicos de PCR e precauções?

I. Princípio experimental

A PCR é um método de amplificação seletiva artificial de DNA in vitro, semelhante à replicação de DNA em um organismo. A replicação de DNA em organismos requer modelos, precursores, DNA polimerases, DNA helinases, dNTPs; E a reação de PCR in vitro também requer componentes semelhantes, como modelos, precursores, tampões de PCR, enzimas Taq, dNTPs。 onde os primeiros são uma sequência específica projetada artificialmente para alcançar a amplificação de um local específico; PCR Buffer fornece um ambiente tampão para a reação; O processo de reação é semelhante ao de um organismo, onde a dupla cadeia de DNA se abre, o precursor se liga ao modelo e se estende para formar uma nova cadeia. Estes processos são desencadeados no organismo por meio da DNA helinasa, enquanto que fora do organismo são realizados por meio do controle da temperatura de reação. A dupla cadeia é aberta com DNA de modelo de degeneração de 94 ° C, o precursor é ligado ao modelo a temperatura de cozimento e, finalmente, a extensão é concluída a 72 ° C e o processo é repetido repetidamente para obter uma grande amplificação de segmentos específicos de DNA. Só no início do terceiro ciclo é produzida a mesma molécula de DNA que a seção de DNA alvo, o que adiciona a duplicação da seção de DNA alvo.

Na fase posterior da amplificação, devido à acumulação do produto, tornando a resposta inicialmente exponencialmente aumentada em curvas planas, o produto já não aumenta significativamente com o número de ciclos, o que é chamado de efeito de plataforma. O período de Plataforma permitirá que os produtos não específicos de baixa concentração, originalmente produzidos por mal-combinados, continuem aumentando significativamente para níveis mais elevados. Portanto, o número de ciclos deve ser adequadamente ajustado para terminar a reação antes do período da plataforma e reduzir os produtos não específicos. O número de ciclos necessários para chegar ao Plateau depende da cópia do modelo na amostra.

II. Principais componentes

Os modelos podem ser de várias formas, incluindo principalmente DNA genômico, DNA plasmódico, DNA genômico que carrega vírus, produtos de PCR, cDNA, etc., mas não RNA. Para diferentes tipos de modelos, a principal diferença é o tempo de preditividade e a quantidade de modelos. Geralmente, o tempo de predição do DNA genômico grande é suficiente para 10 minutos, o DNA plasmódico é suficiente para 2 minutos, o DNA genômico que carrega o vírus é preditivo para 2 minutos e o produto de PCR é preditivo para 2 minutos.

Observe que o cDNA é DNA de cadeia única, mas ainda pode ser um modelo para PCR, exceto que apenas um precursor se liga para sintetizar outra cadeia no primeiro ciclo. A partir da segunda rodada, ambos os primeiros ligam-se a locais específicos, permitindo a ligação com a PCR convencional. O mesmo RNA como cadeia única não pode ser amplificado por PCR, porque a reação de PCR é realizada pela DNA polimerase, que só pode identificar a cadeia de DNA deliberadamente.

2. Para a quantidade do modelo, a massa geral do DNA do sistema 25ul é de 50100ng. Para o DNA genômico, devido à sua estrutura mais complexa, a concentração de extração também tende a ser maior. Para evitar que a concentração excessiva afete a PCR, é necessário diluir gradientemente o DNA extraído. Caso contrário, concentrações excessivas podem causar amplificações não específicas. Os produtos plasmídicos e PCR não precisam ser diluídos devido à sua estrutura simples e às concentrações de extração geralmente baixas.

Quais são as questões a serem observadas no teste de PCR?

Nenhum valor CT

O resultado do teste encontrou nenhum valor de Ct, verifique se houve os seguintes problemas:

1, o número de ciclos é insuficiente (geralmente não mais de 45 ciclos, não apenas o valor de fundo melhorado, quantificação também não é permitida);

2, a configuração do programa de PCR é errada e as etapas de detecção do sinal fluorescente são erradas. O método SG geral é coletado durante a extensão de 72 ℃, a lei TaqMan geralmente coleta o sinal no final do refresco ou durante a extensão, além de se a coleta de fluorescência é selecionada;

3, decomposição de precursores ou sondas. Detecção de degradação de precursores e sondas por eletróforese PAGE;

4, a quantidade de modelo pode se degradar ou a quantidade de amostra é insuficiente (não superior a 500ng, de acordo com as instruções do kit), a amostra de concentração desconhecida deve começar com a concentração mais alta da amostra diluída em série; Se ocorrer a degradação do modelo, deve ser considerada a introdução de impurezas na preparação da amostra e a situação de congelação repetida, recomenda-se que a amostra do modelo seja dividida em pequenas quantidades para evitar a congelação repetida;

Se a sonda de precursor é adequada (especialmente se o precursor atravessa os endons para garantir a amplificação do DNA genômico); O valor de Tm do transbordador acima de 4 ° C também afeta a amplificação).

CT tarde demais

Em quantificação relativa, o valor de Ct é geralmente melhor controlado entre 1525, se em quantificação absoluta, o valor de Ct aumenta para amostras com baixo número de cópias, mas geralmente não é aconselhável exceder 40 ciclos, caso contrário a quantificação é imprecisa.

Portanto, determinar se o valor de Ct é anormal ou não tarde demais é necessário de acordo com o projeto e o propósito específicos do experimento.

1) Eficiência de expansão baixa. a proporção inadequada entre o primer ou entre o primer e a sonda requer otimização; O desenho da sonda ou do desenho não é razoável e precisa ser redesenhado;

2, o processo de PCR não é adequado, em vez de usar o método de três etapas para a reação, ou otimizar a temperatura de cozimento / extensão, pode reduzir adequadamente a temperatura de cozimento; curto tempo de cozimento / extensão (pode ser prolongado em 10s nas condições de tempo recomendadas);

A concentração de MgCl2 não é adequada, aumentando a concentração de íons de magnésio, etc. Degradação ou quantidade insuficiente de amostragem de vários componentes da reação por PCR;

O produto da PCR é muito longo. Projeto do produto de PCR superior a 500bp;

5) Existem inibidores no modelo. Detecção por PCR com modelos de alta pureza ou diluição do modelo.

Produtos que a empresa está vendendo: