Detecção de comprimento de telómeros

O teste de comprimento de telómeros (telómeros) é uma estrutura especial na extremidade do ADN do genoma linear eucariotico, um complexo de sequências de ADN e proteínas formadas para evitar fusões entre as extremidades normais do cromossomo, garantir a integridade de cada cromossomo, controlar o crescimento celular e o ciclo de divisão, e estar intimamente relacionado com a apoptose, transformação celular e perpetuidade.

　　Detecção de comprimento de telómerosO telômero é uma estrutura especial na extremidade do ADN do genoma linear eucariotico, um complexo de sequências de ADN e proteínas formadas para evitar a fusão entre as extremidades normais do cromossomo, garantir a integridade de cada cromossomo, controlar o crescimento celular e o ciclo de divisão, e estar intimamente relacionado com a apoptose, transformação celular e perpetuidade. O DNA de uma sequência repetida de telómeros humanos é composto por TTAGGG repetidamente ordenados (ver a imagem à direita).

Durante o processo de divisão, as células humanas normais não são capazes de replicar um pequeno segmento de sua sequência no extremo, o que faz com que a célula se encurte um pouco após cada divisão, o que é chamado de "retração do extremo cromossómico". Como o extremo do DNA está protegido pela sequência de telómeros, a replicação de DNA perde apenas uma parte da sequência de telómeros, sem comprometer a sequência de DNA normal. Quando a célula se replica várias vezes e os telômeros se encurtam até um certo ponto, a sequência normal de DNA se torna instável, e as células começam a envelhecer e morrer. Os estudos mostram que, em circunstâncias normais, as células humanas morrem de autotoxinas depois de se dividirem em média cerca de 50 vezes, o que é conhecido como o "limite de Heflick".

Este kit de teste utiliza qPCR de fluorescência bicolor (SYRBgreen + VIC) para detectar o comprimento relativo dos telômeros em sangue, tampão oral ou DNA celular. Esta caixa tem as seguintes características.

Estabilidade: operação fechada durante todo o processo, sem poluição cruzada.

2. confiável: detecção de telómeros e tubos internos para reduzir a interferência entre os orifícios.

A diferença entre as bases internas e os telômeros é reduzida devido a múltiplas cópias.

Conveniência: operação simples, sem passos de eletroferese necessários.

Quantitativo: O valor de CT pode detectar quantitativamente o comprimento relativo dos telômeros.

　　Detecção de comprimento de telómerosÉ um teste relativamente simples que não requer grandes quantidades de DNA inicial (cerca de 50 ng). A proporção T / S é calculada medindo o sinal de telômero (T) com o sinal de gene de cópia única de referência (S), que é proporcional à média de TL (Telomere Length, comprimento de telômero) e, portanto, pode ser usada para determinar o TL relativo. Como a natureza desta técnica pode ser aplicada à detecção de alto fluxo, ela é amplamente usada em estudos de população em grande escala. No entanto, como a Q-PCR fornece apenas quantificação relativa, os dados geralmente não são apresentados em comprimentos absolutos de telômeros na forma de kb, a menos que sejam comparados com linhas celulares de referência com TL médio determinado por outro método. Alguns estudos mostram que o fator de variação dos resultados deste método pode ser superior a 10%. Além disso, devido ao uso de diferentes cópias únicas de genes, os resultados podem variar significativamente entre laboratórios diferentes. Além disso, a Q-PCR não fornece informações sobre os telômeros mais curtos. Finalmente, a Q-PCR para medição de TL pode não ser adequada para estudos de câncer, em que as cópias de genes intrassenarios podem ser replicadas ou perdidas devido à não-multiplicação inteira. Portanto, a aplicabilidade da Q-PCR é limitada a amostras com duplômeros normais e nucleotipos estáveis.

Os telómeros são sequências de repetitividade serial não codificante (TTAGGG) n no extremo do cromossoma linear de todos os vertebrados. A suspensão de cadeia única no extremo 3' do telómero invade o DNA de dupla cadeia, formando um anel T, o que também leva ao deslocamento da cadeia, produzindo um anel D do telómero de cadeia única. Anéis T são estruturas especiais de telômeros que se ligam direta ou indiretamente ao complexo protetor de telômeros Shelterin, protegendo os extremos cromossómicos de serem reconhecidos como rupturas de dupla cadeia de DNA.

Os telômeros são uma estrutura especial na extremidade do cromossoma eunucético composta por sequências de DNA repetitivas e proteínas de ligação a telômeros especiais, onde os telômeros dos vertebrados são compostos por sequências de dupla cadeia curta ricas em g. Os telómeros impedem a degradação, fusão e reorganização dos extremos dos cromossomas, mantendo assim a independência, integridade e estabilidade dos cromossomas. Embora os telômeros não codifiquem, eles são conhecidos pelos cientistas como o "relógio da vida", porque o comprimento e a estabilidade dos telômeros controlam a vida das células e estão intimamente relacionados com o câncer e o envelhecimento das células.

Em células humanas normais, o comprimento dos telómeros diminui gradualmente com a divisão celular, cada vez que a célula se divide, o comprimento dos telómeros diminui um corte, perde 20 a 30 nucleótidos, quando os telómeros diminuem a um certo grau, induzirá a falta de estrutura de proteínas nucleares, desencadear o envelhecimento replicativo, a proliferação celular diminui, o crescimento estaga, a diminuição da secidade, a perda da capacidade de diferenciação e outros fenômenos. Ao mesmo tempo, a perda de certas proteínas de ligação específica do telómero nos telómeros encurtados também pode levar as células a identificar erroneamente o extremo do telómero como um local de ruptura do DNA, iniciando a função de reparação do DNA, levando à fusão terminal entre os cromossomas do telómero curto, a fusão do cromossomo pode causar anomalias da mitofilise celular e estagnação do ciclo celular, desencadeando a apoptose induzida pela proteína p53.

Além disso, as células com mutações genéticas como p53 que causam defeitos no ponto de detecção do ciclo celular saltam sobre o envelhecimento replicativo e a divisão contínua acaba entrando em um período de crise, durante o qual poucas células expressam a telomerase, ativam a atividade da telomerase, reparam e mantêm o comprimento dos telomeras celulares, tornando as células vitais em células cancerosas. Excesso de encurtamento e atividade da telomerase foram encontrados em 90% das células cancerosas, tais como câncer rectal, câncer de mama, câncer de pulmão e câncer de próstata. As doenças causadas pelas anormalidades dos telómeros incluem leucemia, anemia com distúrbios regenerativos, proliferação anormal da medula óssea e cornealização congênita. Os telômeros desempenham um papel extremamente importante no envelhecimento humano e no desenvolvimento de doenças, e as mudanças no comprimento das sequências repetidas dos telômeros determinam o destino das células.Detecção de comprimento de telómerosÉ um método experimental importante no estudo da biologia dos telômeros.

Além disso,Detecção de comprimento de telómerosTambém tem um valor diagnóstico importante em doenças do envelhecimento e tumores. Devido às diferenças de gênero, o comprimento dos telómeros dos cromossomas humanos (comprimento da região de dupla cadeia geralmente entre 0,5 e 20 kb) é muito menor do que a maioria dos organismos modelo de laboratório. E o grau de encurtamento dos telómeros em diferentes células de diferentes indivíduos é diferente, e o grau de encurtamento dos telómeros em diferentes cromossomas dentro da célula também é diferente; Enquanto os telômeros com comprimento inferior a 3 kb são definidos como telômeros curtos, os telômeros mais curtos em vez do comprimento médio do telômero desempenham um papel importante na perda da função dos telômeros, induzindo danos ao DNA e limitando a sobrevivência celular. Portanto, é urgentemente necessário um método que detecte com precisão, simples, rápido e alto fluxo o comprimento dos telômeros humanos e as proporções de telômeros curtos a nível de um único cromossomo.

Durante o desenvolvimento de doenças genéticas relacionadas aos telômeros, quando os telômeros são mais curtos, a doença começa precocemente. À medida que a pesquisa se aprofunda, há um crescente reconhecimento de que fatores de estilo de vida como obesidade, tabagismo, falta de exercício e estresse crônico podem afetar o comprimento dos telômeros nos glóbulos brancos periféricos circulantes. Além disso, o encurtamento dos telómeros que leva à disfunção dos telómeros está associado a muitas doenças relacionadas à idade, como infertilidade, artrite, diabetes, câncer, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas. Portanto, é importante que métodos estáveis e repetitivos de comprimento de telómeros possam prever a ocorrência dessas doenças.

No entanto, praticamente todos os estudos populacionais em grande escala publicados sobre doenças relacionadas aos telómeros são essencialmente estudos de correlação, fornecendo apenas informações sobre o comprimento médio ou relativo dos telómeros. Há ampla evidência de que a resposta a danos ao DNA é desencadeada pelos telômeros mais curtos, o que leva ao envelhecimento replicativo nos mamíferos. O comprimento mais curto dos telômeros é um biomarcador-chave que determina o destino da célula e o início do envelhecimento, mas os métodos que podem detectar telômeros curtos são demorados e exigentes e não podem atingir os requisitos de alto fluxo. Portanto, os métodos existentes de medição do comprimento dos telómeros não são bons ou maus, cada um tem milhares de quedas.

Alterações anormais no comprimento dos telômeros podem ocorrer no início da doença, e o comprimento dos telômeros pode ser um indicador de triagem precoce para algumas doenças, ou até mesmo um diagnóstico auxiliar ou avaliação do prognóstico, décadas depois. Métodos simples e fáceis de usar de detecção de alto fluxo podem ser usados ​​para pesquisas epidemiológicas em populações em grande escala para encontrar doenças relacionadas com telómeros, e métodos de detecção mais precisos que fornecem distribuições de comprimentos de telómeros diferentes podem ser usados ​​para encontrar mecanismos possíveis entre o comprimento dos telómeros e doenças relacionadas; É claro que métodos de detecção de telómeros que são precisos e de alto rendimento e que fornecem informações multifacetadas devem ser o objetivo da nossa pesquisa.