Kit de extração rápida de DNA/RNA do genoma viral

Propriedades do produto:

PCRPassos e precauções básicas?

I. Princípio experimental

PCRÉ amplificação seletiva artificial in vitro.DNAUm método que é semelhante ao organismoDNAa cópia. no corpo biológicoDNAA cópia requer modelos, primeiros,DNApolimerase,DNADesiclinase,dNTPse fora do corpo;PCRA reação também requer componentes semelhantes, modelos, primeiros,tampão PCR、Taqenzimas,dNTPs. Onde o precursor é uma sequência específica desenhada artificialmente para alcançar a amplificação de uma posição específica;tampão PCRfornecer um ambiente tampão de reação; O processo de reação é o mesmo que no organismo.DNAA dupla cadeia se abre, o precursor combina o modelo e se estende para formar uma nova cadeia. Esses processos estão no organismo.DNADescadeamento da helinase, enquanto in vitro é alcançado através do controle da temperatura da reação. Como usual94℃Modelo de transgêneroDNAAbra a cadeia dupla, junte o introdutor ao modelo a temperatura de cozimento e, finalmente, no72℃Concluir a extensão e repetir o processo repetidamente para realizar segmentos específicosDNAgrande expansão. Só começa o terceiro ciclo.DNAA mesma seçãoDNAMoléculas que produzem alvos mais circularmenteDNAO índice do segmento é duplicado.

Na fase posterior da expansão,Devido à acumulação de produtos,Transforma a reação inicialmente exponencialmente aumentada em uma curva plana,O produto já não aumenta significativamente com o número de ciclos,Isso é chamado de efeito plataforma. Período da plataforma(Plateau)Isso permitirá que os produtos não específicos em baixas concentrações, originados originalmente devido a uma combinação errada, continuem aumentando significativamente para níveis mais elevados. Portanto, o número de ciclos deve ser adequadamente ajustado para terminar a reação antes do período da plataforma e reduzir os produtos não específicos. Período de chegada à plataforma(Plateau)O número de ciclos necessários depende da cópia do modelo na amostra.

II. Principais componentes

1.Os modelos podem ter várias formas, principalmente genomasDNA, partículasDNAO genoma que carrega o vírusDNA、PCRprodutos,ADNcEspere, mas não para...RNAPara os diferentes tipos de modelos, a principal diferença é o tempo de preditividade e a quantidade de modelos. Geralmente para grandes genomasDNATempo preditivo10 minutosBasta. Plasmida.DNA2minO genoma que carrega o vírusDNAPrevisível2 minutos、PCRPredeterminabilidade do produto2 minutosÉ possível.

AtençãoADNcPara cadeia únicaDNAMas ainda é possível.PCRO modelo, apenas na primeira rodada do ciclo, tem apenas um precursor ligado para sintetizar outra cadeia. Desde o início da segunda rodada, ambos os primeiros são combinados com locais específicos, permitindo assimPCRA ligação. como uma cadeia única.RNAMas não é possível.PCRO aumento é devido à realizaçãoPCRA reação éDNAPolimerase. Só identificada deliberadamente.DNAA cadeia.

2.Quanto à quantidade de modelos, geralmente25ulSistemaDNAA qualidade é50100ngpara o genoma.DNADevido à sua estrutura mais complexa, a concentração de extração também tende a ser relativamente grande, para evitar que a concentração seja excessivamente grande.PCRcausando efeitos, a extraçãoDNARealizar diluição gradiental. Caso contrário, concentrações excessivas podem causar amplificações não específicas. Para as partículas ePCRO produto não precisa ser diluído devido à sua estrutura simples e às concentrações de extração geralmente baixas.

PCRQuais são as questões a serem observadas no experimento??

nãoCTValores

Resultados de teste encontradosCtSituação do valor,Verifique se há os seguintes problemas:

1Número de ciclos insuficiente(Geralmente não mais45Ciclo,Não só o valor de fundo,Quantidade também não.);

2、PCRErro na configuração do programa,Os passos para detectar sinais fluorescentes são errados. GeralSGAdopção da lei72℃Recolha durante a extensãoTaqManAs regras geralmente captam sinais no final do fogo ou durante a extensão.,Se a coleta de fluorescência adicional está selecionada;

3decomposição de primeiros ou sondas. PassávelPáginaDetecção de degradação de precursores e sondas por eletróforese;

4A quantidade do modelo pode se degradar ou ser insuficiente(Não mais.500ng,De acordo com as instruções do kit),As amostras com concentrações desconhecidas devem começar com a concentração mais alta das amostras diluídas em série;Se houver degradação do modelo,Deve-se considerar a introdução de impurezas na preparação da amostra e a ocorrência de congelação repetida.,Recomenda-se que as amostras de modelos sejam divididas em pequenas quantidades,Evite o congelamento repetido;

5A sonda de introdução é adequada(Principalmente, o precursor atravessa os internos.,Para garantir a ampliação do genomaDNA;Atrações para cima e para baixoTmValor superior4℃Isso também afeta a expansão.)。

CTVale tarde demais.

Em quantidade relativa, CtO valor é geralmente controlado1525Melhor entre,Se em quantidade absoluta,Amostras de baixo número de cópiasCtO valor aumentará.,Mas geralmente não é mais do que40Ciclo,Caso contrário, a quantificação é imprecisa.

Portanto...,JulgamentoCtSe o valor aparece tarde demais é anormal,Deve ser realizado de acordo com o projeto e propósito específicos do experimento.

1Ampliação de baixa eficiência. Proporção inadequada entre o primer ou o primer e a sonda,Necessidade de otimização;Projeto não razoável de desenho ou sonda,Precisa de redesenho;

2、PCRProcedimento inadequado,Reagir em três passos,Ou otimizar a recolha/Temperatura prolongada,Temperatura de cozimento pode ser reduzida adequadamente;Incendio/Tempo de extensão curto(Pode ser prorrogado nas condições de tempo recomendadas10s);

3、MgCl2Concentração inadequada,Aumentar a concentração de íons magnésio.PCRDegradação ou quantidade insuficiente de amostragem de vários componentes da reação;

4、PCRO produto é muito longo.PCRDesenho do produto mais500bp;

5Existem inibidores no modelo. Usando modelos de alta purezaPCRDetectar ou diluir o modelo.

Produtos que a empresa está vendendo: