Transferência de amostras: evitar poluição e perdas

Quando as amostras são transferidas do amostrador para o recipiente de manipulação (por exemplo, pratos de petri, centrífugas), é necessário proteger simultaneamente a poluição externa e a perda de micróbios alvo:

Operação em ambiente estéril:

A transferência deve ser realizada dentro de um gabinete de bioseguridade, antes da operação, a cabeça de amostragem, a superfície do recipiente e as mãos do operador devem ser desinfetadas com 75% de álcool; Use uma suína estéril, uma pistola de pipeta (a cabeça da pistola deve ser esterilizada) e evite o contato com áreas não estériles (por exemplo, a parede externa do recipiente).

Aviso de erro: se operar em ambiente aberto, os géreos no ar podem misturar-se com a amostra, resultando em um alto número de colônias, especialmente em amostras de baixa concentração.

Limpeza completa do líquido de amostragem:

Para amostradores de tipo impacto e de forma de filtro, a cabeça de amostragem deve ser lavada repetidamente (pelo menos 3 vezes) com uma solução de lavagem estéril após a amostragem (por exemplo, água salina fisiológica estéril a 0,85%, tampão de fosfato PBS) para garantir que os micróbios ligados entrem completamente na solução de lavagem; Oscilar o vortex por 1 a 2 minutos (velocidade de rotação de 2000 a 3000 rpm), quebrar o agrupamento de micróbios e aumentar a dispersão.

Dilução da amostra: garantir a precisão do múltiplo de diluição

Quando a concentração de micróbios na amostra é elevada, é necessário diluir em gradiente para obter um número contável de colônias (30 ~ 300 CFU / prato), o erro do processo de diluição pode afetar diretamente a precisão dos resultados:

Dilução e recipiente: Use um tubo de diluição de gradiente esterilizado (por exemplo, um tubo de teste de tampa espiral com capacidade de 10 mL), pré-instalado com 9 mL de diluição estéril (o erro é necessário ≤ ± 0,1 mL); Marque claramente os múltiplos de diluição (10-¹, 10-², etc.) para evitar confusões.

Especificações operacionais:

Ao pipetar, certifique-se de que a ponta do tubo de aspiração / cabeça da pistola está 1 a 2 cm abaixo da superfície do líquido, evitando a inalação de bolhas;

Quando diluído de alta concentração para baixa concentração, cada passo deve ser misturado (esfregar o tubo com a mão 10 a 15 vezes) para garantir a diluição uniforme;

Faça 2 a 3 amostras paralelas com o mesmo múltiplo de diluição para reduzir os erros aleatórios.

Cultivo e contagem: controle das condições de cultivo e padrões de contagem

O crescimento dos micróbios é altamente afetado pelas condições de cultura e requer parâmetros rigorosamente uniformes:

Escolha e preparação do meio:

De acordo com o tipo de micróbio alvo escolher o meio de cultura (por exemplo, a detecção de agar nutricional para bactérias, PDA de agar glucosa de batata para fungos), o meio de cultura deve ser completamente esterilizado (121 ° C esterilização a vapor de alta pressão por 20 minutos), e o valor de pH atende aos requisitos (bactérias pH 7.2 ~ 7.4, fungos pH 5.6 ~ 5.8), para evitar que os micróbios não possam crescer devido a deficiências nutricionais ou desconforto ácido-alcalino.

Controle das condições de cultivo:

Temperatura: bactérias 36 ± 1 ° C, fungos 28 ± 1 ° C, a temperatura da caixa de cultivo termostática precisa ser calibrada diariamente (erro ≤ ± 0,5 ° C);

Tempo: cultivo de bactérias por 48 ± 2 horas, cultivo de fungos por 72 ± 2 horas, para evitar que a cultura seja curta demais que leve ao vazamento de colônias ou longa demais que leve à sobreposição de colônias.

Regras de contagem:

Escolha o número de colônias de contagem plana de 30 a 300 CFU (menos de 30 resultados com grande erro, colônias acima de 300 facilmente se sobrepõem);

Se a diferença entre as colônias de placas planas paralelas com a mesma diluição for superior a 2 vezes (por exemplo, as colônias de placas planas com diluição de 10-3 são 20 e 50), é necessário fazer o teste novamente;

A contagem exige a distinção entre os micróbios alvo e as bactérias poluentes (que podem ser avaliadas por meio da morfologia da colônia e da cromoscopia).

Controle de Qualidade: Verificação completa da confiabilidade

Experimento de controle em branco:

Ao processar cada lote de amostras, definir o espaço em branco de amostragem (o amostrador não coleta ar, apenas lavar a cabeça de amostragem depois do cultivo com uma lavagem) e o espaço em branco de operação (lavagem estéril diretamente para a vacinação de cultura), se o número de colônias em branco > 5CFU, indica a existência de poluição, é necessário experimentar novamente.

Controle positivo e taxa de recuperação:

A taxa de recuperação deve ser calculada com a amostragem simulada regularmente com líquidos padrão de concentrações conhecidas (por exemplo, E. coli e Staphylococcus aureus) (a taxa de recuperação deve estar entre 70% e 130%, caso contrário, a eficiência do amostrador ou o processo de processamento deve ser verificado).

Calibração do instrumento:

O amostrador deve calibrar regularmente o fluxo (erro ≤ ± 5%) para evitar desvios de volume de amostragem devido à imprecisão do fluxo;

Equipamentos como pistolas de pipeta e tanques de cultivo precisam ser certificados anualmente para garantir a precisão dos parâmetros.