De acordo com estatísticas, quase80%Os materiais orgânicos e inorgânicos podem ser separados por cromatografia líquida de alta eficiência, onde a cromatografia de fase inversaC18A coluna cromatográfica é a categoria mais comumente usada em cromatografia líquida de alta eficiência. Aqui em baixo.C18Introdução à escolha, manutenção e reparação da coluna cromatográfica.

Um,C18Escolha de colunas

C18Principais considerações de escolha2Um problema é o efeito do preenchimento de colunas e especificações de colunas na coluna cromatográfica.

As propriedades físicas do preenchimento de coluna têm um impacto importante no comportamento cromatográfico do preenchimento. As principais propriedades físicas dos embalagens incluem o tamanho das partículas, o diámetro, o volume dos poros, a química da fase de ligação, o teor de carbono e o tratamento de alquilação.

(1)O tamanho da partícula é o tamanho do diâmetro da partícula da coluna de preenchimento. Na verdade, o tamanho das partículas marcado na coluna cromatográfica é uma média. tamanho das partículas."5μmNão é que todas as partículas em colunas tenham o diâmetro5μmNa verdade, há uma distribuição de partículas. Essa distribuição tem um papel importante na contrapressão da coluna e na eficiência da coluna. Em geral, quanto menor o tamanho médio das partículas, menor a distribuição das partículas, maior o efeito da coluna cromatográfica e maior a contrapressão. AtualmenteC18O tamanho das partículas de enchimento da coluna4～10μmEntre.

(2)O orifício é o espaço entre as partículas de preenchimento. O diámetro do orifício geralmente chamado refere-se ao diámetro médio do preenchimento. A distribuição média do orifício após a instalação da coluna de preenchimento esférico é relativamente estreita, a estrutura da cama de coluna é uniforme, o efeito da coluna é alto e a reprodutividade é boa; A distribuição média do orifício do preenchimento amorfo é mais ampla, a estrutura do leito de coluna é desigual, a velocidade linear do fluxo é desigual e a banda espectral é alargada. O tamanho médio da abertura tem um grande efeito na separação de compostos macromoleculares, e pode haver um efeito de bloqueio molecular ao separar amostras que contêm moléculas maiores ou um efeito de adsorção que afeta a taxa de recuperação quantitativa e a precisão. Portanto, ao separar amostras de proteínas ou peptídeos com cromatografia de fase inversa, deve ser considerado o uso de grandes orifícios.(Como30 nm)O enchimento de coluna inversa. O volume de poro como parâmetro da porosidade do silicone, na separação e análise de compostos moleculares maiores pode ser usado como referência, escolhendo o volume de poro maior de enchimento de coluna inversa.

(3)Os preenchimentos de fase de ligação química ocupam um lugar extremamente importante na cromatografia líquida de alta eficiência. Pode ligar grupos orgânicos de maior polaridade, usando solventes de menor polaridade como fase de fluxo. Também pode ligar grupos orgânicos de menor polaridade, escolhendo solventes de maior polaridade como fase de fluxo.C18A coluna cromatográfica é ligada por silanização.(Si-O-Si-C)No entanto, este tipo de reação de ligação é atualmente a mais utilizada. Como o triclorosilano de octalaquilo e o silicone totalmente porosoM-Porasil-C18Reação gerando fase de ligação química de alquilo, nome comercialO M-Bondapak-C18- É.

(4)O teor de carbono é a quantidade de carbono no enchimento. A técnica de medição tradicional é aquecer o preenchimento até a ruptura da ligação de hidrocarboneto e, em seguida, calcular o conteúdo de carbono medindo o peso perdido ou o dióxido de carbono formado. O teor de carbono pode ser aumentado aumentando o comprimento da ligação de carbono ou aumentando a densidade da ligação. O teor de carbono aumenta e o valor de retenção dos pilares aumenta. O comportamento cromatográfico da fase de ligação está relacionado com a densidade de ligação, mas também com a densidade do silicone e a área de superfície do preenchimento, quanto maior a densidade do preenchimento, maior a quantidade de silicone necessária para o preenchimento, maior o teor de carbono do pilar. Se usar2As colunas de enchimento de preenchimento com densidades diferentes e o mesmo teor de carbono, seu comportamento de retenção será claramente diferente. Portanto, não é suficiente prever o comportamento cromatográfico em termos de carbono sozinho.

(5) C18O reagente de silanização é maior do quede 2 nmmacromoléculas, portanto, ligadas a bases de silicol vizinhas.C18Os reagentes de silanização produzem uma resistência estéreo grave. Seus resultados resultam em uma grande quantidade de bases de silicol residuais na superfície do silicone que não reagem com o reagente de silanização, e essas bases de silicol polares podem interagir com os compostos alcalinos sob certas condições cromatográficas causando um atraso pico, o que pode afetar os resultados da análise quantitativa. Estes problemas podem ser superados em parte através do tratamento de alquilação. O tratamento de alquilação é uma reação independente realizada na fase de ligação para reduzir os bases de silicol na superfície do silicone. Alcilação com moléculas pequenas(Como o trimetilsilano)reagentes, cuja obstrução espacial é muito menor do queC18Grupo. A maioria das fases fixas30%Posição de ligação cobrível. A cobertura máxima é alcançada por certos reagentes químicos extremamente ativos e condições especiais de reação.50%Uma boa compreensão das propriedades físicas da fase de ligação de silicone ajudará a escolher a coluna cromatográfica adequada em uma reação de cromatografia líquida de alta eficiência. Na superfície.C18Embora a função química da coluna seja a mesma, mas na verdade de marcas diferentesC18O desempenho da coluna pode variar significativamente, resultando em diferentes resultados de separação.

A escolha do preenchimento da coluna está relacionada com a possibilidade de separação cromatográfica, enquanto a escolha das especificações da coluna afeta diretamente a velocidade da análise, a capacidade de separação, a capacidade de detecção e o consumo de solvente por análise. As especificações da coluna incluem dois aspectos: o diâmetro interno da coluna e o comprimento da coluna. Diâmetro interno da coluna, o tipo de análise é geralmente2～6 mm,Tipo de preparação20 milímetrosAdultos podem chegar80 milímetrosComprimento da coluna, tipo analítico5～30 centímetrosTipo de preparação15～50 centímetrosEm geral, o diâmetro interno da coluna não afeta a relação entre a separação e o tempo de análise. Hoje, a tecnologia de colunas evoluiu para que colunas de diferentes diâmetros internos possam ter o mesmo desempenho. As colunas de diferentes diâmetros internos têm características, para o mesmo tempo de análise e grau de separação, as colunas de diâmetro interno maior consomem mais solventes do que as colunas de diâmetro interno menor. Por outro lado, as colunas com diâmetros internos menores também requerem menos quantidade de amostra para o mesmo sinal de detecção. Portanto, no volume de amostra * é possível usar uma pequena coluna de diâmetro interno. O aumento do comprimento da coluna pode melhorar o efeito de separação, mas a resistência também aumenta e a pressão de entrada deve ser aumentada. A pressão da coluna é o principal obstáculo para aumentar a separação e reduzir o tempo de análise. O grau de separação, o tempo de análise e a pressão da coluna são restritos uns aos outros, escolha os dois.3Um fator também foi escolhido. Colunas longas podem fornecer alta separação, colunas curtas podem fornecer separação rápida, podemos escolher colunas cromatográficas adequadas de acordo com a situação da amostra.

C18Princípios básicos da escolha de colunas:

(1)A escolha de preenchimento com selagem de tratamento de alquilação pode evitar o fenômeno de atraso de compostos alcalinos.

(2)Escolha colunas com alto teor de carbono para aumentar o valor de retenção.

(3)Escolha colunas mais curtas(Como15 centímetros，7,5 cm)- É.

(4)Escolha embalagens de pequenas partículas.

(5)Para componentes de grande peso molecular, escolha colunas de preenchimento de grandes orifícios.

Dois.C18Utilização e manutenção diária dos pilares

No trabalho diário de análise de separação, o uso adequado da coluna cromatográfica afeta diretamente a vida útil da coluna cromatográfica. AbaixoC18Coisas a serem observadas no uso diário da coluna.

(1)Os pilares devem ser leves ao carregar e descarregar e substituir, e as juntas devem ser apertadas com moderação. As vibrações mecânicas fortes devem ser evitadas para evitar a criação de espaços no leito de colunas.

(2)Se o instrumento for usado para análises convencionais, com uma variedade limitada de amostras, mas com um grande número de análises, você pode configurar para cada tipo de análise convencional1Pilares dedicados à raiz, o que ajuda a prolongar a vida útil dos pilares.

(3)Se o dispositivo de controle de temperatura de coluna for usado, deve-se prestar atenção ao aquecimento após a fase de fluxo de entrada.

(4)A fase de fluxo precisa ser desgasificada antes de ser usada para evitar a redução do efeito da coluna e a detecção de impacto. A solução da amostra precisa ser pré-tratada e filtrada adequadamente para reduzir a poluição e o bloqueio da coluna.

(5)Ao substituir o tipo de fase de fluxo, deve prestar atenção à intersolvência do solvente para evitar a ocorrência do fenômeno da análise salina.

(6)A pressão operacional real da coluna deve ser inferior à pressão máxima no momento do enchimento, de preferência abaixo da metade da pressão máxima. Geralmente não mais20 593.965～29 419,95 kPa. Em baixa pressão(≤14 709,975 kPa)O uso da gama permite que a coluna mantenha um alto efeito de coluna por um longo período de tempo.

(7) C18A coluna cromatográfica é uma coluna cromatográfica de fase ligada não polar, de fase de fluxoO pHO valor deve ser estritamente controlado.2～7para não danificar os pilares.

(8)Após a conclusão do trabalho de análise de separação, não deve ser imediatamente parado, o sistema de análise cromatográfica precisa ser lavado em tempo útil, em geral0,5 horasacima para remover as impurezas dentro da coluna cromatográfica.

(9)Se houver sal na fase de fluxo, primeiro limpe completamente com água. Se for uma amina(Como as trimetaminas ou tetrabutilaminas)Adicionado à fase de fluxo, para usar50%Metanol e0.05%Enxague a solução de ácido fosfórico com solventes misturados, não apenas com água.

(10) C18Geralmente, o metanol é usado como solvente de conservação para evitar danos causados pela ruptura seca da coluna. É estritamente proibido que a água ou a solução tampão permaneçam no fluxo cromatográfico por um longo período de tempo.

(11)Escolha o adequadoC18Colunas de proteção para proteger as colunas de análise contra partículas de impurezas e interferências de adsorção irreversível. O tamanho de partículas do preenchimento dentro da coluna de proteção deve ser o mais consistente possível com o tamanho de partículas do preenchimento da coluna de análise.

(12)O período de conservação da coluna não deve ser muito longo. Não necessário a curto prazo.C18Colunas, lavar com metanol30～60 minutosEm seguida, feche as duas extremidades da coluna. Os pilares não usados ​​por mais tempo, um é tomar o método de lavagem regular e selagem; Segundo, após a lavagem, colocar as duas extremidades da coluna1Só um recipiente cheio de metanol com uma certa capacidade.(Só uma extremidade.)para complementar a evaporação do solvente dentro da coluna durante um período de armazenamento mais longo.

Três.C18Manutenção de colunas

No processo de uso diário da coluna cromatográfica, apesar da proteção rigorosa, a amostra e a fase de fluxo, apesar do pré-tratamento, mas após um longo período de uso, ainda é difícil * evitar a poluição da coluna, perda de fase fixa, colapso da placa, colapso da coluna e queda do efeito da coluna. Alguns podem ser restaurados parcialmente através de reparações.

1,Tecnologia de regeneração de poluição de coluna

Após a poluição da coluna cromatográfica, pode ser lavado com o solvente adequado para regenerar o efeito da coluna.C18O método convencional de lavagem regenerativa da coluna é: metanol e triclorjiaano, respectivamenteMetanol./ Água60 mLAtravés da coluna cromatográfica, depois com metanol.60 mLDepois de armazenar a coluna cromatográfica de equilíbrio, o efeito da coluna voltará ao normal. Se necessário, de acordo com a natureza da poluição(Poluição orgânica, sal, etc.)Adopção0,05 mol/L H2SO4e0,5 mol/L de H3PO4ou0,1 mol / L EDTAO sal de sódio é lavado, depois lavado com água e, finalmente, selado após a coluna cromatográfica equilibrada com metanol. Para poluição graveC18A coluna pode ser lavada com água, metanol, cloroformo e etano, depois de ser lavada em ordem inversa.1Cada vez que o solvente é usado60 mLNão conectar o detector e, finalmente, selar a coluna cromatográfica de equilíbrio com metanol.

2,Reparação de poluição de colunas

Quando a regeneração da poluição da coluna é ineficaz ou a poluição da coluna é grave, pode ser resolvida usando o método de reparação da coluna, mas a profundidade da poluição da coluna não deve exceder5 milímetrosO método é cavar a parte poluente com uma pala especial, misturar a mesma fase fixa e a fase de fluxo do preenchimento da coluna para formar uma pasta e, em seguida, completar cuidadosamente a fase fixa da pasta na parte cavada.(Tente manter a fixação pós-preenchida tão próxima quanto possível da densidade original)reparar a superfície. A coluna reparada, se o orifício da tela das duas extremidades da cabeça da coluna for consistente, pode inverter a coluna para o uso do tempo normal, com o objetivo de restaurar a densidade do leito da coluna com o efeito de lavagem da fase de fluxo.

3,Reparação do colapso da coluna

Há muitas razões para o colapso da coluna. Para o colapso é menos grave, se o orifício da tela das duas extremidades da cabeça do cilindro é consistente, o cilindro pode ser invertido para o uso do tempo normal e o desempenho pode ser restaurado. Quando o colapso é grave(5 milímetros)左右)Quando, pode ser usado o método de reparação da poluição da coluna para reparar.