4 de abril de 2025, Instituto Scripps, Califórnia, EUAProf. Kendall W. NettleseO Professor John R. Yates III, como coautor da comunicação, publicou um artigo intitulado “Native top-down proteomics enables discovery in endocrine-resistant breast cancer” na revista Nature Chemical Biology.Este artigo desenvolveu umProteômica nativa de cima para baixo (nTDP)Para identificar um complexo proteómico de ≤70 kDa em células de câncer de mama, incluindo um modelo de resistência endócrina que sobreexpressa o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR).104 complexoformas de 17 complexos de proteínas(Formas específicas de montagem de complexos de proteínas). O estudo descobriu que o EGFR induz a dissociação do soma do conjunto do fator de transporte nuclear 2 (NUTF2), enquanto os locais modificados após a tradução K4 e K55 do NUTF2 têm um efeito diferenciado na inibição da via de sinalização do receptor de estrogênio (ER). O estudo revela as características moleculares do proteoma do câncer de mama e o papel das complexoformas no crescimento do tumor e na resistência ao tratamento, oferecendo uma nova perspectiva para a compreensão dos mecanismos da doença e o desenvolvimento de medicamentos.

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um

Antecedentes da pesquisa

Os dados mais recentes da Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer da OMS mostram 2,26 milhões de novos casos de câncer de mama em todo o mundo em 2020, superando os 2,2 milhões de casos de câncer de pulmão. O câncer de mama substituiu o câncer de pulmão como o maior câncer do mundo. As proteínas formam complexos energéticos bem sucedidos através de interações não covalentes que impulsionam quase todas as funções-chave relacionadas com tumores malignos dentro da célula, incluindo câncer de mama, e uma variedade de proteóformos produzidos por cortes diferenciais, variações de sequência, modificações pós-traduzidas (PTMs) ou mutações podem afetar a formação, estabilidade e atividade desses complexos funcionais. Os métodos proteômicos tradicionais de baixo para cima têm limitações no esclarecimento de proteoformas produzidos por proteínas individuais, na caracterização de ligandos e cofatores ligados a complexos de proteínas e no mapeamento de padrões de PTMs combinados. Embora a proteômica nativa de cima para baixo (nTDP), combinada com a espectroscopia de massa nativa (MS) e a proteômica de cima para baixo (Top-down Proteomics), tenha capacidade de análise estrutural, o nTDP é atualmente usado principalmente para a análise de complexos de proteínas purificados, com menos aplicações em amostras biológicas complexas devido à baixa abundância de complexos de proteínas em amostras biológicas complexas, dificuldades de separação de complexos de proteínas e a falta de ferramentas bioinformáticas para lidar com conjuntos de dados de nTDP em grande escala. No estudo do câncer de mama, a sinalização do fator de crescimento é um dos principais mecanismos de resistência ao tratamento endócrino, com a amplificação do receptor epidérmico do fator de crescimento (EGFR) e mutações dos componentes de sinalização a jusante associadas à resistência clínica ao tamoxifeno, mas os mecanismos específicos ainda não estão claros. Portanto, a necessidade de uma abordagem eficaz para estudar as características do conjunto de proteínas em células de câncer de mama para uma compreensão aprofundada dos mecanismos moleculares da doença e o projeto de medicamentos eficazes forneceu o contexto e a motivação para o desenvolvimento e a aplicação da estratégia nTDP para o estudo.

dois

Métodos de pesquisa

1

Pesquisa:

Células de câncer de mama MCF-7 positivas para o receptor de estrogênio alfa (ERα) (denominadas células MCF-7) e células MCF-7 que sobreexpressam o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (denominadas células MCF-7-EGFR como modelo resistente ao tratamento direcionado ER).

2

Fluxo de trabalho nTDP

O fluxo de trabalho nTDP desenvolvido pelos pesquisadores é mostrado na Figura 1, primeiro usando cromatografia de bloqueio de tamanho nativo offline (nSEC) para extrair um complexo de proteína solúvel das células para a separação; Posteriormente, através do nano-ESI-FAIMS-MSn (Fase líquida: Easy-nLC 1200, separador de fase gás: FAIMS, espectro de massa: Orbitrap Fusion Lumos)Análise nativa top-down dos complexos proteicos; Último usoProSight NativoO software combina a correção manual para analisar dados complexos de espectro de massa.

Figura 1: fluxo de trabalho nTDP (clique para ampliar)

Três.

Resultados da pesquisa

1

Verificação do fluxo de trabalho nTDP

Os pesquisadores usaram primeiro três complexos de proteínas: carbonic anhydrase II(CA II，~29.1 kDa)，streptavidin (SA， ~53 kDa) ，avidin (AV，~67 kDa) Para verificar a reprodutividade e robustez do sistema nano-ESI-FAIMS-MSn. Os resultados mostraram que o sistema pode separar e fragmentar complexos de proteínas de forma estável, produzindo dados espectrônicos de massa que podem esclarecer eficazmente a caracterização das proteínas (Figuras 2-4). Também foi verificado que o FAIMS pode isolar complexos de proteínas de até 70 kDa a nível de fase gás. (Figura 5)

Figura 2: Espectrograma nTDP do CA II e seu fragmentograma gerado pelo ProSight Lite (clique para ampliar)

Figura 3: Espectrograma nTDP da SA e seu fragmentograma gerado pelo ProSight Lite (clique para ampliar)

Figura 4: Espectrograma nTDP do AV e seu fragmento gerado pelo ProSight Lite (clique para ampliar)

Figura 5: Mapa de migração do pico de base do complexo proteico padrão e seus valores CV

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2

nTDP analisa MCF-7 e

MCF-7 - extrato de células EGFR

Em seguida, os pesquisadores isolaram extratos celulares de células de câncer de mama (MCF-7 e MCF-7-EGFR) com o sistema nSEC, e os resultados da espectroscopia nSEC mostraram que os complexos proteicos extraídos de MCF-7 e MCF-7-EGFR (16 experimentos repetidos) estabilizaram a separação eficaz. Os complexos proteicos isolados foram testados com o sistema nano-ESI-FAIMS-MSn104 complexoformas de 17 complexos de proteínasincluindo os complexos proteína-metal, proteína-proteína-metal e proteína-proteína.

Figura 6: Espectrograma nSEC de marcadores de proteínas e agregados de proteínas em MCF-7, gelatograma de agregados de proteínas em células MCF-7, espectrograma nSEC de marcadores de proteínas e agregados de proteínas em MCF-7-EGFR, gelatograma de agregados de proteínas em células MCF-7-EGFR. (Clique para ver a imagem)

3

Análise de caracterização de complexos de proteínas associados ao câncer de mama

• Formas complexas de TPI:A TPI é uma glicosilase associada ao câncer de mama e estudos sugerem que a TPI pode estar associada à resistência a medicamentos, progressão do tumor e metastases. Os pesquisadores observaram a estrutura do dímero TPI em células MCF-7 e MCF-7-EGFR com uma massa molecular de aproximadamente 53 kDa (fracção nSEC-4). O complexo TPI dimérico é formado por uma combinação de variantes de proteína monomérica truncadas e fosforiladas, com duas desamidas (N15 e N71) na variante de proteína monomérica. Os pesquisadores também descobriram que o complexo TPI é formado por um monómero TPI mutante (E104D) e que o TPI da subunidade monómera E104D pode ser fosforizado, desamidado ou acetilado.

Figura 7: Espectrograma nTDP do complexo TPI complexoforms no extrato de células MCF-7 (clique para ver imagem maior)

• Formas complexas de MIF:A MIF é uma citocina multifuncional de relevância biológica em uma variedade de cânceres, doenças autoimunes e inflamações, e os pesquisadores descobriram que a MIF é altamente expressa em células MCF-7 e MCF-7-EGFR, e a espectrometria nativa de MS1 fornece informações detalhadas sobre as complexoformas da MIF, formando um total de cinco estruturas trimétricas de MIF (homogêneas e heterogêneas). através de MSnA análise espectroscópica encontrou variantes abreviadas, não modificadas, nitrilizadas e acetiladas da proteína monomérica MIF (nitrilização e acetilação ocorreram em C80 e K77, respectivamente).

Figura 8: Espectrograma nTDP do complexo MIF complexoforms no extrato de células MCF-7 (clique para ver imagem maior)

• Formas complexas de SOD1:A enzima metálica SOD1 é um antioxidante importante para a formação de tumores da mama impulsionados por genes cancerígenos e a conversão de superóxidos em O.2e H2O2É essencial. Os pesquisadores observaram a estrutura dimérica do SOD1 com uma massa molecular de cerca de 32 kDa em células MCF-7 e MCF-7-EGFR, observando Cu na subunidade da variante da proteína SOD1 a partir do espectrograma MS1 (11 + estado de carga) e do espectrograma MS2 (6 + estado de carga).2+e Zn2+A ligação não covalente de íons metálicos, a variante da proteína SOD1 também vem com acetilação N-terminal, remoção de um par de ligações dienxofre (C57-C111) e metionina N-terminal.

Figura 9: Espectrograma nTDP do complexo SOD1 complexoforms no extrato de células MCF-7 (clique para ver imagem maior)

• Formas complexas NUTF2:NUTF2 é uma proteína dimérica que mediam o transporte intranuclear da pequena enzima GTP Ran. Os pesquisadores identificaram um total de oito variantes da proteína NUTF2 de combinações PTM diferentes a partir de células MCF-7 e MCF-7-EGFR, e estes monômeros foram distribuídos em 26 complexoformas diferentes. A partir do espectrograma MS1, foi encontrado que o conteúdo do complexo de dímeros NUTF2 endógenos no MCF-7-EGFR foi significativamente reduzido em comparação com as células MCF-7 e que os isómeros NUTF2 com três acetilações eram específicos das células MCF-7-EGFR.

Figura 10: Espectrograma nTDP de NUTF2 em extratos de células MCF-7 e MCF-7-EGFR (clique para ver imagem maior)

Figura 11: Informações sobre a força de complexoforms e proteoforms de NUTF2 em extratos de células MCF-7 e MCF-7-EGFR (clique para ampliar a imagem)

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4

NUTF2 mediar a interação entre EGFR e vias ER

Os resultados dos dados nTDP anteriores descobriram que o número de dímeros NUTF2 em células MCF-7-EGFR era significativamente menor do que em células MCF-7, e os pesquisadores usaram NUTF2 para co-sedimentar com dois marcadores de afinidade diferentes para verificar o resultado.EGFR induz a dissolução do dímero do fator de transporte nuclear 2 (NUTF2). Os locais de modificação pós-tradução (PTM) do NUTF2 são conservadores em vertebrados, e a estrutura cristalina do complexo da proteína NUTF2 indica que o K4 está perto do local de ligação à proteína nucleoporosa. O K55 e o K63 estão perto dos locais de ligação do Ran, onde o K55 está envolvido no contato mediado pela água entre o Ran e o NUTF2, por isso os pesquisadores mutaram os locais K4 e K55. Os resultados mostram queA expressão de NUTF2 nas células MCF-7 inibe o crescimento das células de câncer de mama, a mutação K4Q reverte essa inibição e a mutação K55R aumenta a inibição.Isso sugere que os locais PTM (K4, K55) podem regular o crescimento celular afetando a ligação ao poro nuclear ou a interação Ran. NUTF2 reduz o gene de proliferação induzido por estrogênio GREB1, e a mutação K4Q pode restaurar este fenótipo sem 4OHT. Isso sugere que proteoforms NUTF2 em diferentes locais PTM podem levar a diferentes resultados biológicos.

Figura 12: NUTF2 regula a transmissão de sinal de ER e inibe o crescimento

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Para estudar ainda mais como NUTF2 regula a sinalização ER e a resposta a 4OHT, a análise técnica CUT&RUN descobriu que os locais de ligação ER-NUTF2 em células MCF-7 não se sobrepõem, mas a expressão NUTF2 e o tratamento 4OHT alteram o padrão de ligação ER. A expressão de NUTF2 provoca diferenças na ligação de ER em 1.353 locais, e MCF-7 e MCF-7 após o tratamento com 4OHTNUTF2Os locais de ligação ER das células se sobrepõem e diferem. No entanto, apenas 132 semilocais comuns da sequência de base ER (ou seja, '1-AGGTCA') foram encontrados em locais NUTF2 sensíveis a 4OHT, sugerindo que o NUTF2 regula a participação e a atividade da cromatina ER por meio de mecanismos indiretos. Para entender melhor o mecanismo molecular da inibição do crescimento da NUTF2, os pesquisadores completaram a sequência de RNA das células MCF-7 e MCF-7NUTF2, e a análise de enriquecimento do genoma mostrou que existem mais de 600 genes de expressão diferencial, incluindo genes relacionados com a decomposição do RNA regulada para cima, componentes do complexo NuRD (como HDAC1) e genes apoptoticos ERRFI1, genes relacionados com a fosforilação oxidativa mitocondrial regulada para baixo (como BCL2) e genes cancerígenos (como os da família RAS). A análise de enriquecimento de vias mostrou que esses genes estão envolvidos em várias vias relacionadas ao câncer e ao EGFR, apoiando o papel do NUTF2 como fator de sinalização do EGFR. Estudos de proteômica próxima ERα-APEX2 mostraram que a expressão NUTF2 altera os grupos de interação do ER, incluindo o aumento do marcador JunB e a diminuição dos marcadores de inibidores tumorais HSPBP1 e CSDE1. Comparando as células NUTF2:WT e NUTF2:K4Q, diferenças foram encontradas nos grupos de interação ER (por exemplo, aumento do marcador CNOT9 e diminuição do marcador DNMT3A), confirmando ainda que NUTF2 afeta a via regulando as interações das proteínas relacionadas com ER.

Figura 13: Interação NUTF2-ER

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quatro

Conclusão e significado

1

Implementação bem sucedida da metodologia nTDP

O estudo otimizou o fluxo de trabalho nTDP, combinando cromatografia de bloqueio de tamanho nativo (nSEC) offline, ionização nano-electrospray (nano-ESI), espectroscopia de migração de íons asimétricos de campo (FAIMS) e espectroscopia de massa serializada em múltiplos estágios (MSn), identificando com sucesso 104 complexoformas de 17 complexos de proteínas em células de câncer de mama (MCF-7 e MCF-7 -EGFR), incluindo complexos proteína-metal, proteína-proteína-metal, proteína-proteína, etc., que podem caracterizar conjuntos de proteínas endógenas de ≤70 kDa, superando as limitações dos métodos tradicionais para analisar complexos de proteínas de baixa abundância em amostras biológicas complexas.

2

Descoberta e análise funcional de complexos proteicos críticos

Identificou-se complexos de proteínas críticas associadas ao câncer, tais como fosfato-propilasa isomerase (TPI), inibidores de migração de macrófagos (MIF) e complexoformas de superóxido-discriminase (SOD1), identificando seus locais de modificação pós-tradução (PTMs), tais como desamida de TPI, fosforilação, nitritilação de MIF, acetilação, locais de ligação metálica de SOD1, etc., e seus efeitos na estrutura e função do complexo. A sobreexpressão do EGFR induz a separação do dímero do fator de transporte nuclear 2 (NUTF2). O dímero NUTF2 participa da entrada nuclear da RAN como uma proteína de transporte do poro nuclear, cuja sobreexpressão inibe o crescimento das células de câncer de mama, enquanto mutações em diferentes locais PTM (K4 e K55) revertem ou intensificam esse efeito de inibição, sugerindo que os PTMs de NUTF2 afetam o crescimento do câncer de mama regulando a via de sinalização do receptor de estrogênio (ER).

3

Mecanismo de associação da NUTF2 à resistência endócrina ao câncer de mama

O NUTF2 inibe o crescimento das células de câncer de mama, regulando indiretamente a ligação ao DNA e a rede de interações proteicas do ER, como o gene de proliferação induzido por estrogênio GREB1, o gene apoptotico ERRFI1, etc. A sobreexpressão do EGFR (modelo de resistência ao tratamento endócrino) reduz os níveis de dímeros do NUTF2 e altera o seu padrão de PTMs, resultando em efeitos anormais de regulação do NUTF2 no sinal ER, provavelmente um dos mecanismos importantes da resistência ao tamoxifeno mediada pelo EGFR.

4

Significado do nTDP

Este método fornece um novo paradigma para a análise em larga escala de complexos de proteínas endógenas em amostras biológicas complexas, capaz de preservar interações não covalentes frágeis e caracterizar com precisão os PTMs, padrões de montagem e ligações de ligantes de proteoformas, abrindo novos caminhos para a biologia do câncer, a descoberta de alvos de drogas e a pesquisa em biologia estrutural, especialmente para a compreensão dos mecanismos moleculares da resistência ao tratamento do câncer de mama.

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