Kit de preparação de células sensíveis de alta eficiência

Kit de preparação de células sensíveis de alta eficiência

Número de catálogo:30018

Composição, armazenamento e estabilidade:

Use a curto prazo de 4 ° C para evitar a poluição. Conservação a longo prazo - 20 ° C por ano.

Os parâmetros de um produto específico dependem dos parâmetros da descrição do produto recebida

Introdução do produto:

1. Kit de preparação de células sensíveis de alta eficiênciaÉ desenvolvido com base em métodos tradicionais de preparação de células sensíveis de alta eficiência, com fácil operação e alta eficiência de conversão.

2. Usando este kit, a eficiência do estado de sensação pode atingir 10⁸cfu/μg de plásmidos. A eficiência é ligeiramente maior para os prósmidos pequenos e ligeiramente menor para os prósmidos grandes. As células sensíveis de alta eficiência preparadas com este kit não são apenas capazes de converter plasmídeos, mas também são perfeitas para a conversão de produtos de conexão comuns, especialmente para situações que exigem alta eficiência de conversão, como conexões planas de conversão.

3. O uso deste kit é simples e a preparação de células sensíveis de alta eficiência leva apenas cerca de 60 minutos após a cultura bacteriana.

4. Este kit é adequado para a maioria das bactérias E. coli comuns, incluindo Top 10, DH5α, BL21 (DE3), JM109, TG1, HB101 e XL-1. Mas a eficiência da conversão pode variar significativamente de espécie para espécie.

5. Este kit pode ser usado várias vezes para preparar um total de 100 células sensíveis de 100 μl.

v Atenção:

1. Todos os reagentes, materiais de consumo, instrumentos e equipamentos devem ser esterilizados.

2. LB sem antibióticos são usados ​​durante a preparação de células sensáticas. LB sem antibióticos também devem ser usados ​​em culturas de 37 ° C após choque térmico durante o uso de bactérias sensáticas, mesmo que os plasmídeos transferidos sejam resistentes.

3. Depois de preparar as células sensíveis, mude rapidamente para -70 ° C.

Etapas de operação:(Leia as observações antes do experimento.

1. Placa revestida:

Para obter uma eficiência óptima no estado de sensação, a glicerina ou outras formas conservadas de bactérias devem ser aplicadas em comprimidos LB e cultivadas durante a noite.

2. Vacinação:

Tome um comprimido LB com uma espécie de bactéria recém-cultivada e as operações subsequentes são realizadas em uma mesa ultra-neta. Mergulhe o topo da pinça em 70% de álcool e queime ligeiramente na lâmpada de álcool para deixar o topo da pinça estéril. Usando uma pinça, pegue uma cabeça de plástico estéril ou uma barra de dentes, escolha um único clone da placa e coloque a cabeça de plástico ou a barra de dentes mergulhada na bactéria em um tubo de cultivo bacteriano com 3 ml de SOB ou LB (o cliente deve escolher o meio apropriado de acordo com a bactéria). As operações acima também podem ser realizadas usando anéis de vacinação, etc.

3. Cultivo:

37 ° C cerca de 250 rpm cultivo durante a noite, geralmente o tempo de cultivo é adequado para cerca de 16 horas. Nunca mais de 18 horas.

4. Re-vacinação:

Dependendo da quantidade de células sensíveis de alta eficiência necessárias para serem preparadas, são cultivadas com bactérias nocturnas recém-cultivadas em uma proporção de 1:500. Por exemplo, tomar 100 microlitros de bactéria nocturna fresca para 50 ml de SOB ou LB e cultivar a cerca de 250 rpm a 37 ° C.

5. Preparação das células sensoriais:

em Nota: a velocidade de rotação da centrifugadora e o tempo de centrifugação são muito importantes para a produção de células sensíveis, e a velocidade óptima de rotação e o tempo de centrifugação de diferentes tipos de bactérias são diferentes e devem ser otimizados de acordo com a situação específica. A melhor condição é a velocidade apropriada de rotação e o tempo de centrifugação para que as bactérias se centrifugem exatamente, mas não podem ser muito apertadas, caso contrário, a suspensão é difícil, só pode ser soprada com força para ser suspensa novamente, causará danos às células e afetará a eficiência da conversão.

1) Quando a bactéria cultivada OD600 atingir cerca de 0,5, coloque a bactéria cultivada em banho de gelo e resfrie por 15 minutos. Observação: Todas as operações subsequentes devem ser realizadas em 4 graus ou banho de gelo.

2) 4 ℃ (a centrífuga deve ser pré-arrefecida) 3000-3500g centrífuga por 5 minutos para recolher as bactérias, descartar a limpeza (tente remover a limpeza limpa, quanto menos resíduos, melhor).

3) Se a quantidade de micróbios antes da precipitação centrífuga for de 50 ml, a operação de seguimento é realizada e, se for outro volume, a operação de seguimento é realizada após a conversão proporcional.

4) Prepare a solução de alta eficiência pré-refrigerada de 10 ml para respendir suavemente a precipitação bacteriana (para facilitar a ressuspensão, você pode adicionar uma pequena quantidade de solução A, ressuspender e adicionar a solução restante A), quando soprar a ressuspensão deve ser muito suave, caso contrário, afetará o efeito.

5) Banho de gelo por 15 minutos.

6) 4 ℃ (a centrífuga deve ser pré-arrefecida) 3000-3500g centrífuga durante 5-7 minutos para recolher as bactérias e descartar a limpeza.

7) Prepare a solução B com 2 ml de estado de sensibilidade pré-refrigerado e ressuspenda suavemente a precipitação bacteriana. Deve ser suave quando soprar, caso contrário, afetará o efeito.

8) Banho de gelo por 15 minutos.

9) Divisão no banho de gelo, que pode ser devidamente dividido em 50-200 microlitros / tubo, conforme necessário.

10) Conservar imediatamente após o uso ou congelamento com banho de gelo seco de nitrogênio líquido ou etanol em -70 ° C.