Kit de clonagem de veículo pBLUE-T T4 Principal Veículo e outros

NobeladeKit de clonagem de veículo pBLUE-T T4 Principal Veículo e outros

Kit de clonagem de veículo pBLUE-T

Número de catálogo: 42014

Composição, armazenamento e estabilidade:

Armazenamento a 20 ° C, não afeta o efeito do uso durante 6 meses.

Os parâmetros de um produto específico dependem dos parâmetros da descrição do produto recebida

Introdução do produto:

Muitas DNA polimerases de alta temperatura, tais como Taq DNA polimerase, Tth DNA polimerase, etc., amplificam os produtos da PCR em 3'-Os terminais são acompanhados por uma base A saliente, de modo que o produto de PCR pode ser usado em 3'-O veículo com uma base T saliente na extremidade posterior é facilmente clonado. O veículo pBLUE-T é derivado do plasmídeo pBlueScript II SK(+), com a sequência apropriada adicionada no ponto de corte da enzima EcoRI, que resulta diretamente na base T não emparelhada em seus extremos 3’ após corte da enzima XCM I, com maior eficiência de recombinação. Os dois locais ECOR I projetados exclusivamente em ambas as extremidades dos locais de inserção do veículo pBLUE-T permitem que os segmentos de inserção possam ser detectados com monocesão ECOR I econômica e eficiente; Além disso, o veículo pBLUE-T não contém os locais NdeI ou NcoI restritivos, o que facilita a clonação de genes que contêm os locais acima mencionados. Além disso, o sistema de conexão do veículo da empresa possui características como baixo fundo (menos de 10% das manchas azuis), alta taxa de recombinação (mais de 90% das manchas brancas têm segmentos inseridos) e conexão rápida. As informações técnicas relacionadas ao veículo pBLUE-T são listadas no final desta nota, cuja sequência completa pode ser referenciada à sequência SK(+) do pBlueScript II, mas com uma sequência ligeiramente diferente no local da polyclonase.

A sequência pode ser realizada com o iniciador T3, T7 e o iniciador de sequência universal M13 (veja o gráfico posterior)

Passos operacionais:

1. Preparação da reação de conexão:

Se o produto de PCR deve ser purificado depende da qualidade do produto amplificado. Se o produto da PCR for muito limpo, a reação de ligação pode ser realizada diretamente sem purificação. No entanto, se o produto de PCR é baseado em plasmídeos como modelo, ele deve ser purificado e os plasmídeos do modelo também podem formar manchas brancas. PCROs produtos podem ser separados por eletróforese em gel de againe. A nossa empresa produz um kit de reciclagem de purificação rápida de produtos de DNA para 7Fragmentos de DNA acima de 0 bp podem ser bem recuperados.

Produtos de PCR amplificados por DNA polimerase Taq, Tth, AmpliTaq e KlenTaq, todos com um 3’ saliente nas extremidades-A。 Possui3’-Os produtos da PCR no terminal A podem ser clonados diretamente com o veículo pBLUE-T. Tem 3’®5’ O produto de PCR amplificado pela DNA polimerase (polimerase de alta fidelidade) com atividade externa é de extremo plano, para clonar este produto de PCR de extremo plano, a linha 3’ deve ser excelente-Função A.

2. Reações gerais de conexão:

1) Em um padrão de 10ml Conecte o sistema de reação, adicionando 1ml30% do pblue-ttransportadores, Xml PCRProduto (em condições normais, não é necessárioPCRQuantificação precisa do produto, a proporção molar do produto de PCR e do veículo é otimizada para 2: 1 ~ 10: 1 para obter bons resultados, recomendado 3: 1).1ml 10´tampão ligaçãoe 0,5-1ml(DNA T4 de 2,5-5 unidades de WeissLigase， O resto é reabastecido com água. A reação é realizada de acordo com o seguinte sistema:

A ligase de DNA T4 é adicionada.

2) Conexão a 16 ° C durante a noite (geralmente pode ser feita em um instrumento de PCR).

Geralmente recomendado 16 ° C ligação durante a noite (10mlA quantidade padrão de ligação do sistema é de 2,5Unidades WeissÉ possível obter o maior número de conversores. Mas o sistema com o PEG Enhancer aumenta a eficiência da conexão várias vezes.，Em casos de alta quantidade de enzimas de ligação (10mlA dose recomendada do sistema de ligação é de 5Unidades WeissConexão de 16 ° C por 30 minutos pode atingir os requisitos gerais de pesquisa.

3)Resfriar no gelo e, em seguida, transformar ou armazenar a -20 ° C.

3. Reação rápida de conexão:

1) A reação é realizada de acordo com o seguinte sistema:

A ligase de DNA T4 é adicionada.

2) 22 ° C ligação por 5-10 minutos (geralmente pode ser feito em um instrumento de PCR).

2 ´O Quick Ligation Buffer já contém todos os componentes de ligação rápida otimizados, geralmente recomendado para uma ligação de 22 ° C por 10 minutos（10mlEnzima de ligação do sistema é de 5Unidades WeissAs conexões de segmentos longos podem ser prolongadas até 30 minutos) geralmente podem obter resultados satisfatórios. Além disso, o sistema também pode ser conectado a 16 ° C por 30 minutos (10mlEnzima de ligação do sistema é de 5As unidades de Weiss são necessárias para a pesquisa geral.

3)Resfriar no gelo e, em seguida, transformar ou armazenar a -20 ° C.

4. Conversão:

ð50-100ml Células sensíveis, colocadas no gelo, depois de descongelar, suavemente lavar várias vezes para suspender as células uniformemente.

ðJunte-se 4-5mlO líquido de conexão (que pode ser adicionado até totalmente, desde que o volume não exceda 1/10 do volume das células sensíveis) é misturado suavemente. Colocar no gelo30 minutos. 42 ℃ banho de água quente 90Um segundo. Colocação no gelo 2~ 3 minutos.

ðMais 500mLB ou SOC (sem antibióticos), 37°C 150 rpmCultura de oscilação por 60 minutos.

ðSerão 200mlBactérias revestidas em pré-uso 16ml 50 mg / ml IPTGe 40ml 20 mg/ml X-gal revestido em comprimidos de ampecing micina.

A dose de bactéria revestida é ajustada adequadamente de acordo com a eficiência da conexão e a sensibilidade das células sensíveis, se menos clonação prevista, parte do líquido de cultura pode ser absorvida por centrifugação (4.000 rpm, 2 minutos), deixando a quantidade adequada de meio de cultura em suspensão de bactéria após a retirada total ou a quantidade moderada pode ser revestida em uma placa (o líquido restante revestido pode ser mantido em 4 graus e conservado no dia 2, se o número de colônias convertidas for menor, o líquido restante pode ser revestido em uma nova placa de cultura).

ðO comprimido é colocado em direção a 37 ° C por 1 hora para absorver o excesso de líquido e, em seguida, inverte a cultura durante a noite.
5 Filtração:

1). Filtração azul e branco do conversor:

Quando um fragmento de DNA exótico é inserido no pBLUE-TDepois, devido às fontes externasA presença de uma sequência de ácidos nucleicos no DNA altera a codificação do gene LacZ, afetando seu produto.b-Semilactosidaseum-A atividade do fragmento e, portanto, o clone recombinante é apresentado em branco na placa X-gal/IPTG, em vez do clone recombinante em azul. Às vezes.Inserir segmento sem efeitoA caixa de leitura do gene lacZ, ou o fragmento inserido é muito pequeno, nesse caso a colônia (clone recombinante) apresenta um azul claro ou uma mancha azul claro no centro da colônia, com o círculo exterior branco (olho de peixe azul mancha). Escolha colônias brancas ou azuis claros que cresçam em comprimidos IPTG / X-gal, selecione um barraco de dentes para um meio líquido contendo ampecing micina e cultive durante a noite a 37 ° C.
2). Identificação do conversor:

a.Extrair o plasmido com a bactéria da colônia branca cultivada acima, cortar com monoenzima ECOR I ou com outra enzima apropriada, eletróforese em gel de againe para verificar o tamanho do fragmento para determinar se contém o fragmento de destino.

b.Escolha as colônias brancas para teste PCR direto (veja a versão 3 da Clonação Molecular ou consulte-nos)

c) Sequenciamento de subiniciadores T3 e T7 ou outros iniciadores adequados para determinar se a clonação destinada é contida.

Como calcular a quantidade de produtos de PCR necessários para a reação de conexão?

A proporção molar do produto de PCR e do veículo é otimizada para 2:1 a 10:1 (recomendado 3:1) para obter bons resultados, usando a seguinte fórmula:

[A quantidade de inserção do veículo (ng) × tamanho do segmento de inserção (kb) ÷ tamanho do veículo (kb)] × a proporção molar do segmento de inserção e do veículo = a quantidade do segmento de inserção (ng) Por exemplo: a proporção molar do segmento de inserção e da conexão do veículo é de 3: 1, se a reação de conexão adicionar o veículo 40ng, o tamanho do segmento de inserção é de 1000bp, então a quantidade do segmento de inserção deve ser adicionada como [40ng veículo × 1kb inserção do segmento ÷ 2,984kb veículo] × 3/1 = 40,2ng.

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