Teste do fator de apoptose Caspase-389

Teste do fator de apoptose Caspase-389

Caspase3

CaspasaÉ uma família de proteases que desempenham um papel importante no processo de apoptose celular. Caspase3, também conhecida como CPP32, é uma enzima-chave no processo de apoptose que pode cortar procaspase 2.6, 7 e 9 e pode cortar muitos substratos de caspase diretamente específicos, incluindo: PARP (poly(ADP-ribose) polymerase), ICAD (Inhibitor of caspase-activated Deoxyri- bonuclease), gelsolin Fodrin e outros. Estes cortes proteicos mediados pela caspase 3 são uma parte importante do mecanismo molecular da apoptose celular. A caspase 3 também desempenha um papel fundamental na apoptose celular, incluindo a cromatoplasma.

fragmentação do DNA, etc. A caspase 3 também desempenha um papel fundamental na bolha celular.

O princípio de detecção é baseado no fato de que a casepase 3 pode catalisar o substrato AC-DEVD-pNA para produzir um pNA amarelo (-itroanilina), o que permite detectar a atividade da caspase 3 através da medição da absorção. O pNA tem uma forte absorção perto de 405nm. A curva padrão produzida com referência ao produto amarelo pNA pode servir como um padrão para a quantificação da atividade da enzima caspase 3.

Caspasa-8

A caspase 8 é considerada a caspase a jusante na sinalização da apoptose, e a caspase 8 é ativada durante a apoptose mediada pelo receptor Fas e TNFR-1, formando um dímero composto por p18 e p10, que ativa ainda mais a jusante a caspase 4, a caspase 6. Caspase 9 e Caspase 10. Este método é baseado na capacidade da Caspase 8 de catalisar o substrato AC-IETD-pNA para produzir um pNA amarelo (-nitranilina), permitindo que a atividade da Caspase 8 seja detectada através da medição da absorção. O pNA tem uma forte absorção perto de 405nm. Os valores de OD de 405nm da amostra de detecção podem ser calculados com referência à curva padrão produzida pelo pNA para a atividade da enzima Caspase 8 da amostra.

Caspasa-9

A caspase 9, também conhecida como ICE-LAP6 ou Mch6, é uma célulaApoptoseA caspase acima durante o processo de transmissão de sinal. Depois que as mitocondrias liberam o citocromo C, a caspase 9 pode formar um complexo com o citocromo C e Apaf1, enquanto é ativada. A caspase 9 ativada pode ativar a enzima-chave da apoptose caspase 3, promovendo assim o sinalizamento subsequente da apoptose. A ativação da Caspase 9 pode ser regulada por fosforilação.

Este método é baseado em Caspase 9 que pode catalisar o substrato Ac-LEHD-pNA para produzir "pNA amarelo cru (p-nitroanilina), que pode ser detectado através da medição da absorção.

Atividade da Caspase 9. O pNA tem uma forte absorção perto de 405nm. Os valores de OD de 405nm da amostra de detecção podem ser calculados com referência à curva padrão produzida pelo pNA para a atividade da enzima Caspase 9 da amostra.

Caspase1

Caspase2

Caspase4

Caspase6

Fator de Apoptose Caspase3/8/9 Preparação da amostra de teste:

1) amostras de células: Tome 1x107 células (cerca de 1 T25 quantidade de células de garrafa de cultura), centrifugar 600g 4 ° C para coletar as células por 5 minutos, absorver cuidadosamente a limpeza superior e lavar uma vez com PBS. Após a extração da limpeza superior, cada amostra de célula tubular é adicionada a 100u de lisote e resuspendido, o banho de gelo é fissado por 15 minutos. 4 ° C 16.000 g de centrifugação durante 10-15 minutos, transferindo o líquido superior para um tubo de centrifugação pré-refrigerado em banho de gelo. Determine imediatamente a atividade enzimática da caspase 3 ou conserve amostras a -70 ° C. Ao mesmo tempo, uma pequena quantidade de amostras pode ser tomada para medir a concentração de proteína pelo método Bradford, tentando alcançar a concentração de proteína de 1-3 mg / ml.

2) amostra de tecido: adicionar um crachado de 100ul a cada 10mg de tecido e homogenizar com um homogeneizador de vidro em um banho de gelo. Em seguida, transferir a mistura homogênea para um tubo centrífugo de 1,5 ml e o banho de gelo se desintegra por mais 5 minutos. 4 ° C 16.000 g de centrifugação durante 10-15 minutos, transferindo o líquido superior para um tubo de centrifugação pré-refrigerado em banho de gelo. Determinação imediata da atividade enzimática da caspase 3 ou conservação de -70 ° C

amostras. Ao mesmo tempo, uma pequena quantidade de amostras pode ser tomada para medir a concentração de proteína pelo método Bradford, tentando alcançar a concentração de proteína de 1-3 mg / ml.

Curva padrão de detecção de atividade de Caspase-3

Ciclo experimental: concluído dentro de 7-10 dias úteis, a oferta de teste repetido.

Atenção ao cliente

Anticorpos: consulta préviaEstudo em XangaiBiológico, genério de anticorpo claro e se o anticorpo está disponível. Se não puder ser negociado pelas partes, o cliente compra a oferta ou a nossa empresa;

Coleta e conservação de espécimes:

① amostra de tecido: tecido fresco colocado em nitrogênio líquido ou conservado em 70 graus, tecido não inferior a 100 mg (aproximadamente o tamanho do feijão verde);

② Cultura de células: através da contagem celular, pegue não menos de 000000 células em tubos EP, adicione 0,5 ml de água salina ou protetor protetor de proteína, depois de misturar, guarde no frigorífico (-70 ° C, para evitar o congelamento repetido);

3. amostras de células sanguíneas: preservação de amostras de sangue com anticoagulante ou separação de células com separação de linfocitos, adicionando 0,5 ml de água salina ou protetor protetor de proteína, conservação (-70 ° C pode ser conservado a longo prazo, para evitar o congelamento repetido)

Amostras de soro ou líquido de cultura celular: remover as impurezas por centrifugação e remover-as em tubos EP para conservar (a temperatura acima de 4 ° C pode ser conservada por 15 a 20 dias, -70 ° C pode ser conservada a longo prazo para evitar o congelamento repetido)

Transporte de amostras: você pode enviar amostras de qualquer um dos seguintes modos

① amostras de tecido, amostras de células são transportadas por gelo seco ou adicionadas ao protetor protetor de proteína após o transporte de sacos de gelo;

② As amostras de células também podem ser enviadas diretamente às garrafas de cultura (o selo garante não poluição, o líquido de cultura não vaza, as células não crescem demasiado cheias, cerca de 50%, enchendo o líquido de cultura);

Sero ou líquido de soro superior é enviado diretamente com sacos de gelo (selado para garantir que o líquido não saia, a distância visual pode ser alcançada em quase 2-3 dias).

Experimento em serviço: