Sonda fluorescente de íons de cálcio Fluo-8 AM, Cell Permeant

Sonda fluorescente de íons de cálcio Fluo-8 AM, Cell Permeant

Perfil do produto

Fluo-8（Fluo-2 Medium Affinity）， É a mais brilhante sonda de fluorescência de comprimento de onda de excitação de luz visível Ca2 +, com intensidade de fluorescência duas vezes mais forte do que o Fluo-4 e quatro vezes mais forte do que o Fluo-3. Fluo-8 tem um nível médio de afinidade Ca2 + quase próximo Fluo-3，Fluo-4（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM）， É usado quase como Fluo-3 e Fluo-4. O Fluo-8 não só mantém as propriedades de detecção espectral convenientes do Fluo-3, Fluo-4, com um comprimento de onda de excitação máximo de 490nm após a ligação ao Ca2 + e um comprimento de onda de emissão máximo de 514nm. Também tem uma carga celular melhorada e capacidade de resposta ao Ca2 +. O carregador Fluo-8 tem uma dependência de temperatura mais fraca e a incubação a temperatura ambiente ou 37 ° C é bem tingida, ao contrário do Fluo-3, o Fluo-4 exige estritamente a incubação a 37 ° C, esta característica torna-o mais adequado para experimentos de triagem de alto fluxo HTS. Fluo-8 é amplamente utilizado e é compatível com muitas linhas celulares e amostras alvo, sem interferência de ligandos ou sinalização alvo em si.

O Fluo-8 pode detectar mudanças nos níveis de íons de cálcio dentro da célula através de microscópios de confocalização a laser, citometros de fluxo, calibradores de fluorescentase, microscópios de fluorescência, etc. Fluo-8, AM é um derivado do acetil metil do Fluo-8, com permeabilidade na membrana celular e fácil acesso às células com uma simples cultura. Uma vez que entra na célula, é cortado pela sua esterase para produzir Fluo-8 que não é permeável à membrana e permanece dentro da célula para desempenhar a função fisiológica correspondente.

Este produto está na forma de pó congelado e seco em uma embalagem pequena de 50ug, com concentrações recomendadas de 1-5uM para a detecção de níveis intracelulares de Ca2 +.

Sonda fluorescente de íons de cálcio Fluo-8 AM, Cell Permeant

Características básicas

Sinônimos: Fluo-8, AM

Formula molecularA: C50H50N2O23

Peso Molecular：1046.9316

SolubilidadeSolução em DMSO (1-5 mM)

Ex / Em490/514 nm (ligação Ca2+)

Condições de armazenamentoConservação a -20 ° C, período de validade de 1 ano.

Sonda fluorescente de íons de cálcio Fluo-8 AM, Cell Permeant

Uso

A Preparação do Reagente

1) Preparação da solução mãe Pluronic F-127: Adicione 500 ul de DMSO em 100 mg de pó Pluronic F-127 (Cat No. FS0432) e prepare a solução mãe de 20% (W / V). O processo de dissolução precisa ser aquecido a 40-50 ° C por 20-30min. A solução é conservada a temperatura ambiente, sem refrigeração. Se houver cristalização, a solução pode ser reaquecida sem afetar o uso.

2）HHBS BUFFER(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer,pH7.3) Ou outros tampões fisiológicos.

B Passos operacionais

1) Dissolver Fluo-8, AM com DMSO sem água para fazer um líquido de armazenamento de 1-5mM, ou remover o líquido de armazenamento Fluo-8, AM equipado a temperatura ambiente. (Por exemplo: se for preparado para uma líquida mãe de 4 mM, é necessário adicionar 11,9 ul de DMSO sem água a 50 ug de Fluo-8, AM).

2) Diluir o líquido de armazenamento com HHBS ou outro tampão fisiológico Fluo-8, AM + DMSO para um líquido de trabalho de 1-10uM, adicionando antecipadamente a quantidade apropriada de solução Pluronic F-127 de 20% para a sua concentração final de 0,02%.

[Nota (1)]: A concentração de carga recomendada de Fluo-8, AM aplicada na maioria das células é de 4-5uM, a concentração específica de uso deve ser otimizada de acordo com os requisitos experimentais. Para evitar a sobrecarga causando citotoxicidade, recomenda-se a utilização de baixas concentrações de sonda zui com base nos resultados obtidos.

[Nota (2)]: Fluo-8, líquido de trabalho AM deve ser usado atualmente para evitar congelamento repetido.

[Nota (3)]: Pluronic F-127 impede que o Fluo-8, AM se aglomere em solução e estimula a sonda a entrar melhor nas células. No entanto, o Pluronic F-127 reduz a estabilidade do Fluo-8, AM, por isso é recomendado adicionar apenas durante a preparação do líquido de trabalho e não é recomendado adicionar o líquido de armazenamento para conservação a longo prazo.

3) [Opcional] Se a célula contém um transportador aniônico orgânico, Probenecid (1-2,5 mM) ou Sulfinpyrazone (0,1-0,25 mM), pode ser necessário adicionar ao meio de cultura celular para reduzir o vazamento da sonda de desesterização.

[Nota (1)]: O líquido de armazenamento de propylsulfone ou sulfpirona é bastante alcalino, portanto, é necessário reajustar o pH após a adição do meio de cultura.

4) Adicione o fluido de trabalho Fluo-8, AM preparado às células, a quantidade de adição depende da cobertura das células. Incubar a temperatura ambiente a 37 ° C ou 20-60 min.

[Nota (1)]: no que diz respeito ao tempo de incubação, se o primeiro ci fazer o experimento não pode ser determinado, recomenda-se incubar primeiro 30min, ver o efeito de fluorescência; Se as células morrerem mais, reduzir o tempo adequadamente; Se a intensidade da fluorescência for muito fraca, prolonge o tempo adequadamente.

Nota (2): A redução da temperatura de carga da sonda pode reduzir a zonalização da sonda.

5) Absorba o líquido de trabalho de coloração e substitua-o por HHBS ou outro tampão fisiológico (se necessário, com um tampão contendo inibidores do transportador, como ácido propylônico de 2,5 mm) para remover a sonda excessiva.

6) Usando instrumentos apropriados, como confocação a laser, citométrio de fluxo, calibrador de fluorescentase, etc., com comprimento de onda Ex / Em = 490 / 520nm para a detecção.

[Nota (1)]: Fluo-8, AM entra na célula e é degradado pela esterase para formar Fluo-8, que não permanece no citoplasma sob a forma de ligação de oferta e preço. Portanto, as células vivas carregadas com corantes não podem ser tratadas de forma fixa para a detecção do nível de Ca2 +.

Precauções

1) tintos fluorescentes uniformemente no problema de extinção, por favor, tente evitar a luz para retardar a extinção de fluorescência.

2) Acetilóximetil (AM) é fácil de absorver umidade, depois de retirar o frigorífico, por favor, deixe em um ambiente seco até a temperatura ambiente após a abertura. Devido à quantidade mínima de reagente, centrifuge-o brevemente antes da abertura para garantir que o pó caia no fundo do tubo.

3) Fluo-8, AM em 4 ° C, banho de gelo e outras condições de baixa temperatura será coagulado e colado no fundo do tubo centrífugo, ou parede do tubo ou tampa do tubo, pode ser usado em 20-25 ° C durante um momento até a dissolução total.

4) Fluo-8, AM primeiro uso, o líquido de armazenamento é recomendado para uso atual, dividido em uma única dose, rigorosamente para ≤ -20 ° C selado congelamento seco para evitar a umidade. Para garantir bons resultados experimentais, tente usar o menor tempo possível.

5) Para sua segurança e saúde, por favor, use a roupa experimental e use luvas descartáveis ​​para operação.