Kit de teste de potencial de membrana mitocondrial JC-1

Perfil do produto

JC-1Kit de teste de potencial de membrana mitocondrial（Kit de ensaio de potencial de membrana mitocondrial JC-1(É um tipo deJC-1Kits para sondas fluorescentes para detecção rápida e sensível de mudanças no potencial de células, tecidos ou membranas mitocondriais purificadas. A diminuição do potencial da membrana mitocondrial é um evento emblemático no início da apoptose celular. Portanto, este kit pode ser usado para a detecção precoce da apoptose.

JC-1É amplamente utilizado para detectar o potencial da membrana mitocondrial△ψmSonda de fluorescência ideal.JC-1Os corantes se acumulam nas mitocôndrias de forma dependente do potencial e podem ser usados ​​para detectar o potencial das células, tecidos ou membranas mitocôndriais purificadas. Dentro das mitocôndrias normais,JC-1Aggregando-se na matriz mitocondrial para formar polímeros que emitem intensa fluorescência vermelha (Ex=585 nm, Em=590 nm）； Mitocondrias insalubres devido à diminuição ou perda do potencial da membrana,JC-1Só pode existir na forma de monomero no plasma, produzindo fluorescência verde (Ex=514 nm, Em=529 nm）。JC-1Não só pode ser usado para detecção qualitativa, porque as mudanças de cor podem refletir muito diretamente as mudanças no potencial da membrana mitocondrial. Também pode ser usado para detecção quantitativa, porque o grau de despolarização das mitocondrias pode passar pelo vermelho./A proporção da intensidade da fluorescência verde é medida.

Composição do produto

guardare Transporte：-20℃ para conservação seca, pelo menos1ano eficaz. Transporte:Saco de gelotransporte

Uso Kit de teste de potencial de membrana mitocondrial JC-1

1. JC-1Preparação do líquido de trabalho de coloração

Para placas de seis buracos, este kit pode ser detectado100Uma amostra. Necessário para cada buracoJC-1A quantidade de líquido de coloração é1mloutros vasos de cultivo. JC-1A quantidade de líquido de trabalho de coloração e assim por diante; Para cada suspensão celular 50～100Milhões de células necessárias 0,5 ml JC-1Coloração do líquido de trabalho. Leve a quantidade adequada JC-1（200×de acordo com cada50μL JC-1（200×(Adjuntar-se) 8 mlProporção de diluição de água ultrapura JC-1. A vibração intensa é completamente dissolvida e misturada JC-1e depois se juntar. 2mL JC-1Tampon de coloração (5×Após a mistura é JC-1Coloração do líquido de trabalho.

[Atenção]:Tem de ser primeiro. JC-1（200×Mesclar completamente com água ultra-pura (fornecido no kit) antes de adicionar JC-1Tampon de coloração (5×）。 Não configurar primeiro JC-1Tampon de coloração (1×(Reunir-se) JC-1（200×assim). JC-1Será difícil dissolver completamente e afetará gravemente a detecção posterior.

2. Configurações de controle positivo

CCCP（10 milímetrosRecomendação Press 1∶1000 proporção adicionada ao líquido de cultura celular, diluído para 10μMTratar as células 20 minutos. Em seguida, carregue de acordo com o método abaixo JC-1Detecção do potencial da membrana mitocondrial. Na maioria das células, normalmente 10μM CCCPTratamento 20 minutosO potencial da membrana da mitocondria posteriorWanquanPerda,JC-1A observação após a coloração deve ser de fluorescência verde; As células normais JC-1Fluorescença vermelha deve ser mostrada após a coloração. para células específicas,CCCPConcentração e tempo de ação possível

Diferentes, devem ser decididos por conta própria com referência à literatura relevante.

3. Para células suspensas

1）取10～60 Milhões de células, suspensas novamente 0,5 milímetrosNo líquido de cultura celular, o líquido de cultura celular pode conter soro e fenol vermelho.

2(Adjuntar-se)0,5 ml JC-1Colore o líquido de trabalho e misture várias vezes. Caixa de cultura celular 37℃ incubação20 minutos。

3Durante a incubação, de acordo com cada 1mL JC-1Tampon de coloração (5×(Adjuntar-se) 4 mlProporção de água destilada, preparação da quantidade adequada JC-1Tampon de coloração (1×e colocado no banho de gelo.

4）37Após a incubação,600×g4℃ Centrífuga3～4 minutoscélulas precipitadas. Cuidado, tente não remover as células.

5(Utilização) JC-1Tampon de coloração (1×(Lavagem) 2 Próximo: Junte-se 1mL JC-1Tampon de coloração (1×ressuscitar as células,600×g4℃ Centrífuga3～4 minutosDepositar as células e descartar. Junte-se novamente 1mL JC-1Tampon de coloração (1×ressuscitar as células,600×g4℃ Centrífuga3～4 minutosDepositar as células e descartar.

6(Usar a quantidade adequada JC-1Tampon de coloração (1×Após a ressuspensão, observe com microscópio fluorescente ou microscópio confocal a laser, também pode ser usado por espectroscopia fluorescente Detecção fotométrica ou análise citométrica de fluxo.

4. Para células adesivas

[Atenção]Para as células adesivas, se você deseja usar um espectrofotômetro fluorescente ou um citométrio de fluxo para a detecção, as células podem ser coletadas primeiro e suspensas novamente para o teste com referência ao método de células suspensas.

1Para um orificio em uma placa de seis buracos, absorva a cultura, disponível de acordo com experimentos específicos, se necessário PBSou outra solução apropriada para lavar as células uma vez, adicionando 1mllíquido de cultura celular. O líquido de cultura celular pode conter soro e fenol vermelho.

2(Adjuntar-se) 1mL JC-1Liquido de trabalho de coloração, misturado completamente. Caixa de cultura celular 37℃ incubação20 minutos。

3Durante a incubação, de acordo com cada 1mL JC-1Tampon de coloração (5×(Adjuntar-se) 4 mlProporção de água destilada, preparação da quantidade adequada JC-1Tampon de coloração (1×e colocado no banho de gelo.

4）37℃ após a incubação, remover o líquido superior,JC-1Tampon de coloração (1×(Lavagem) 2 Segunda vez.

5(Adjuntar-se) 2mLLiquido de cultura celular, que pode conter soro e fenol vermelho.

6Observação sob microscópio fluorescente ou microscópio confocal a laser.

5. Para mitocondrias purificadas

1(Será preparado JC-1Recuperação do líquido de coloração JC-1Tampon de coloração (1×(diluição) 5 Duas vezes.

2）0.9mL 5Diluido por vezes. JC-1Adicionado ao líquido de trabalho de coloração 0,1 mlQuantidade total de proteína é 10～100 microgramasMitocondrias purificadas.

3Detecção com espectrofotômetro de fluorescência ou calibrador de fluorescense: varredura de tempo com espectrofotômetro de fluorescência diretamente após mistura (hora digitalizaçãoO comprimento de onda de estimulação é485 nmO comprimento de onda de emissão é 590 nm. Se um calibrador de fluorescentase for usado, o comprimento de onda de excitação não pode ser definido como 485 nmQuando, pode estar475～520 nmDefina o comprimento de onda de excitação dentro do intervalo. Além disso, você pode consultar os passos abaixo. 6 Configuração de comprimento de onda para a detecção de fluorescência.

4Observação com microscópio fluorescente ou microscópio confocal a laser: métodos e passos abaixo 6。

6. Observação de fluorescência e análise de resultados

detecção JC-1A luz de excitação pode ser definida como 490 nmA emissão de luz é configurada para 530 nmDetecção; JC-1No caso de polímeros, a luz de excitação pode ser definida como 525 nmA emissão de luz é configurada para 590 nm。

[Nota1】A fluorescência não é necessária para definir a luz de excitação e emissão no comprimento de onda máximo de excitação e no comprimento de onda máximo de emissão. Quando observado com microscópio fluorescente, o teste JC-1Os polímeros podem ser usados ​​para detectar iodeto de propidina ou Cy3Utilização de filtros de banda padrão. detecção JC-1Monoméricos podem ser usados ​​frequentemente para detectar FITCou GFPfiltro de banda padrão. A presença de fluorescência verde indica uma diminuição do potencial da membrana mitocondrial e que a célula provavelmente está no início da apoptose. A fluorescência vermelha indica que o potencial da membrana mitocondrial é mais normal e o estado da célula também é mais normal.

Precauções

1）JC-1（200×(Em4℃, banho de gelo e outras condições de baixa temperatura serão coagulados e colados no fundo do tubo centrífugo, parede do tubo ou tampa do tubo, pode20～25Temperatura do banho de água por um momento até a completa derretida.

2(Carregado terminado) JC-1Utilização posterior JC-1Tampon de coloração (1×Ao lavar, deixe JC-1Tampon de coloração (1×(Manter) 4Por volta de ℃, o efeito de lavagem é melhor nesse momento.

3）JC-1Depois de carregar e lavar a sonda, tente 30 minutosconcluir o teste de seguimento. É necessário tomar banho de gelo antes do teste.

4(Por favor, nãoJC-1Tampon de coloração (5×(Todos fabricadosJC-1Tampon de coloração (1×），Este kit deve ser usado diretamente durante o uso.JC-1Tampon de coloração (5×）。

5(Se for descoberto JC-1Tampon de coloração (5×Depois de haver precipitação, deve ser totalmente dissolvido para ser usado, pode ser usado em 37O aquecimento promove a dissolução.

6）CCCPPara inibidores da cadeia de transmissão de eletrônicos mitocondriais, tóxicos, por favor, tome cuidado com a proteção.

7Para sua segurança e saúde, por favor, use o traje experimental e use luvas descartáveis ​​para operação.

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