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Sistema DSF de análise de estabilidade de proteínas de alto fluxo
NegociávelAtualização em12/29
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Visão geral
A fluorometria de varredura diferencial (DSF) em análise de estabilidade de proteínas de alto fluxo é um método de detecção de fluorescência baseado em processos de degeneração térmica de proteínas. A DSF (Fluorescença Endógena) mede rapidamente toda a placa de microporo da amostra sem marcar a amostra ou usar nenhuma sonda fluorescente e fornece dados de alto fluxo para ajudar na triagem de candidatos à amostra e ingredientes da fórmula.
Detalhes do produto
A fluorometria de varredura diferencial (DSF) em análise de estabilidade de proteínas de alto fluxo é um método de detecção de fluorescência baseado em processos de degeneração térmica de proteínas.
Estabilidade da proteína
A estabilidade das proteínas é uma das principais propriedades qualitativas dos medicamentos biotecnológicos que determinam a eficácia, a viabilidade de produção, a segurança e a vida útil dos medicamentos biotecnológicos. A estabilidade estrutural avançada da proteína garante que a proteína permaneça ativa e segura ao longo de sua vida útil.
Estudos de estabilidade são usados para confirmar a estabilidade da estrutura de alta ordem (HOS) da proteína em diferentes condições, tais como temperatura, pH, componentes auxiliares e tempo de armazenamento, para determinar condições adequadas de armazenamento e transporte. Ao mesmo tempo, órgãos reguladores como a FDA, a EMA e outros exigem amplos dados de estabilidade antes de autorizar o uso de medicamentos biológicos. Portanto, a compreensão e a garantia da estabilidade estrutural avançada de medicamentos proteicos terapêuticos é essencial para as empresas biofarmacêuticas desenvolverem medicamentos seguros e eficazes, e os pesquisadores precisam analisar e avaliar a estabilidade estrutural avançada de proteínas em vários estágios de pesquisa e desenvolvimento e produção.
Métodos comuns de análise da estabilidade das proteínas
A análise de estabilidade das proteínas é geralmente estudada usando os seguintes métodos:
Métodos bioquímicos
Espectroscopia de dicroismo circular (CD)
Método térmico de varredura diferencial (DSC)
Tecnologia de PCR Quantitativa (qPCR) (DSF de fluorescência externa)
Métodos de Dispersião de Luz Dinâmica (DLS) e Dispersião de Luz Estática (SLS)
A DSC é frequentemente considerada a solução mais importante para a análise da estabilidade das proteínas, no entanto, a necessidade de análise rápida de grandes quantidades de amostras armazenadas em placas microporosas, como placas 96 ou 384, limita a aplicação da DSC na triagem de medicamentos e no desenvolvimento inicial. Como resultado, a DSF (fluorescença endossocial) tornou-se uma solução popular e econômica.
A DSF (Fluorescença Endógena) mede rapidamente toda a placa de microporo da amostra sem marcar a amostra ou usar nenhuma sonda fluorescente e fornece dados de alto fluxo para ajudar na triagem de candidatos à amostra e ingredientes da fórmula.
O método DSF seleciona rapidamente um grande número de amostras, melhorando significativamente a eficiência da triagem de medicamentos e análise farmacológica, e os resultados da análise são verificados com a tecnologia DSC. Para muitos medicamentos de biotecnologia, o uso do método DSF como triagem rápida em massa e o uso da tecnologia DSC para validar os resultados de triagem precoce do DSF é um programa eficaz para triagem e desenvolvimento de medicamentos.
A DSF tem amplas aplicações no campo da análise de estabilidade das proteínas, incluindo, mas não limitado a:
Detecção da estabilidade térmica da proteína: a maioria das proteínas tem requisitos rigorosos para a temperatura, e a avaliação da estabilidade térmica da proteína contribui para a expressão normal da função da proteína. O DSF não só determina os parâmetros de estabilidade térmica das proteínas em alto fluxo, mas também avalia as mutações, pH、 O efeito de fatores como a intensidade iónica na estabilidade térmica, e a partir deles são selecionados fatores que podem melhorar a estabilidade térmica.
Triagem de alto fluxo de estabilizadores e inibidores de proteínas: obtenção de compostos candidatos para combinação com amostras de proteínas através da triagem de alto fluxo do banco de ligantes de compostos, avaliando o efeito do composto na estabilidade da proteína, para triagem de estabilizadores de proteínas, inibidores, fatores auxiliares e companheiros moleculares.
Estudo do mecanismo de ação das proteínas: por exemplo, estudos de interação proteína-proteína, análise dinâmica de afinidade de novos medicamentos proteicos descobertos, teste de parâmetros de estabilidade térmica de ligações de proteínas e ligantes, fatores auxiliares e parceiros moleculares.
Pesquisa de mecanismos de inibição de compostos de pequenas moléculas: O uso de DSF permite a detecção de múltiplos compostos de alto fluxo e matriz (compostos em combinação com alguns inibidores conhecidos, substratos, produtos ou fatores auxiliares, etc.) para a triagem de inibidores de compostos de pequenas moléculas e o estudo de seus mecanismos farmacológicos.
Estudo da estrutura da proteína: a cristalização da proteína é um meio muito importante para estudar a estrutura da proteína, e o uso do DSF permite a triagem de alta taxa de fluxo para as condições de cristalização da proteína.
Princípios técnicos do DSF:
A fluorescência por varredura diferencial (DSF) é uma técnica biofísica econômica e fácil de usar que determina a temperatura de transformação da proteína (temperatura de transformação térmica Tm ou alteração química Cm) detectando as mudanças correspondentes no espectro de emissão de fluorescência quando a temperatura aumenta ou os agentes de alteração estão presentes.
Os estudos descobriram que os aminoácidos aromáticos em moléculas de proteínas se deslocam no espectro de emissão máximo da fluorescência endogênica estimulada quando estão em microambientes polares diferentes, como hidrofóbicos ou hidrofílicos. A fluorescência endógena nas proteínas vem principalmente de aminoácidos anílicos aromáticos como a triana (Trp), a fenilalanina (Phe) e a tirosina (Tyr), onde a triana é fortemente fluorescente.
Por exemplo, no microambiente nuclear de hidrofobia proteica, o comprimento de onda de emissão máxima de fluorescência endogênica é de cerca de 330 nm, enquanto que no microambiente polar hidrofílico, o comprimento de onda de emissão máxima de fluorescência endogênica da tritina é de cerca de 350 nm. A degeneração térmica ou química das proteínas geralmente provoca uma mudança de polaridade no microambiente ao redor dos resíduos de trânea, o que faz com que a trânea normalmente enterrada no núcleo proteófobo seja gradualmente exposta a um ambiente hidrofílico, o que resulta em um deslocamento em vermelho do comprimento de onda máximo de emissão da fluorescência endógena, ou seja, para uma área de comprimento de onda maior.
Esta abordagem para monitorar as mudanças de fluorescência endógena em trânsito não requer sondas de fluorescência ou rótulos, evitando resultados falsos positivos como fluorescência de fundo e adsorção não específica em DSFs de fluorescência exógena tradicionais.
Quando a proteína se desdobra devido à degeneração térmica ou à ação de agentes químicos de degeneração (como guanina, uréia, etc.), a medição da fluorescência endogênica com a mudança da temperatura ou do agente de degeneração pode estudar o processo de expansão da proteína. Os dados dessas mudanças podem ser usados para gerar curvas de fusão e obter valores Tm da temperatura de transição térmica aparente, Tonset、 A enthalpia de van der Waal (ΔH), a energia livre de Gibbs (ΔG), a degeneração química e outros valores Cm são usados para avaliar e prever a estabilidade das proteínas.
Os DSF tradicionais geralmente usam a proporção 350/330 para a análise de dados, enquanto o SUPR-DSF oferece vários métodos de análise, além da proporção, o SUPR-DSF também fornece BCM (média baricéntrica, média de massa), que pode obter uma melhor relação sinal-ruído do que a proporção 350/330, ao mesmo tempo que é mais favorável para a análise de amostras de proteínas de baixa concentração.
Principais características do sistema DSF de análise de estabilidade de proteína de alto fluxo:
Placa padrão de 384 microporos sem consumíveis e capilares especiais
Filtração de alto fluxo com um processo de aquecimento (60-80 minutos)
Teste de placas de 384 microporos de bloco único com fluorescência endoscênica, sem corantes ou rótulos, compatível com excitação UV LED de sistemas biológicos comuns com testes de espectro completo
Apenas 10-30μl de amostra necessária, concentração de amostra 0,05 ~ 250mg / mL
Obter parâmetros-chave: Tonset, Tm, ΔΗ, ΔG, Cm e afinidade, etc.
Fornecer qualidade e repetibilidade rigorosas dos dados
Aplicações do sistema SUPR-DSF:
Os sistemas SUPR-DSF são amplamente utilizados em pesquisas básicas em ciências da vida e desenvolvimento de medicamentos:
Acelerar a triagem de mutantes
Triagem e otimização de receitas e pré-receitas
Triagem de condições de cristalização de proteínas
Avaliação de coerência entre lotes
Avaliação de biosimilaridade
Estudos acelerados sobre stress e degradação forçada
Análise de mudanças de configuração induzidas em combinação
Avaliação de modificações pós-tradução
Análise de termostato e estabilidade química
Especificações técnicas do sistema DSF de análise de estabilidade de proteína de alto fluxo:
Casos de aplicação típicos -Acelerar a triagem de mutantes
O SUPR-DSF foi usado para comparar e triar 16 amostras, incluindo 1 proteína de tipo selvagem (WT) e 15 mutantes de ponto único. Em 1,5 hora, o instrumento DSF gerou curvas de fusão de alta qualidade para 48 amostras (3 repetições por conjunto) (até 384 buracos de dados podem ser gerados ao mesmo tempo). Os dados são ajustados com o modelo para obter valores de temperatura de fusão Tm e classificar e filtrar a estabilidade.
Como mostrado na Figura 1, as curvas de fusão de três desses mutantes (9, 13 e 14) se deslocaram para a esquerda em comparação com o WT (azul), indicando uma diminuição da estabilidade das proteínas; A estabilidade dos restantes 12 mutantes foi melhorada. Os mutantes 1, 8 e 12 tiveram maior estabilidade.
A Figura 2 mostra as curvas de fusão de várias amostras representativas, mostrando que algumas proteínas sofreram uma única transição térmica (proteína WT com mutantes 7 e 8), enquanto outras (mutantes 1 e 14) mostraram claramente duas etapas de transição térmica, ou seja, dois pontos de viragem na curva de fusão. Os dados fornecidos pelo SUPR-DSF podem ajudar os pesquisadores a selecionar candidatos promissores para pesquisas aprofundadas.
Analisar com precisão a área Fab do monovalente
Usando o SUPR-DSF para obter dados de fluorescência de varredura diferencial do NISTmAb e comparando os resultados com os dados obtidos por termometria de varredura diferencial (DSC). O SUPR-DSF pode analisar todos os três domínios estruturais do NISTmAb: CH2 (69°C), CH3 (83°C) e região Fab (94°C). A temperatura máxima de varredura do SUPR-DSF é de 105°C, permitindo medir com precisão a temperatura de fusão da região Fab anormalmente estável, enquanto a temperatura máxima de varredura de outras plataformas DSF é geralmente de apenas 95°C, o que facilita a perda de informações importantes sobre a deformação de desdobramento da região Fab monoresistente (Figura 5(a)).
Os dados normalizados do SUPR-DSF foram comparados com os resultados do DSC. Como mostrado na Figura 5 (b), os três picos coincidem entre si, demonstrando uma boa consistência entre as duas técnicas, o uso de SUPR-DSF facilita a obtenção de informações de estabilidade de proteína de alta qualidade.
Casos de aplicação típicos - triagem acelerada de ingredientes e fórmulas
A formulação de medicamentos biológicos, como anticorpos, é a base para garantir a eficácia, viabilidade de produção e segurança, e também determina as condições de armazenamento e transporte. As empresas farmacêuticas precisam urgentemente de métodos de alto fluxo para filtrar de forma rápida e confiável uma grande combinação de condições para determinar a melhor fórmula.
Usando o SUPR-DSF, os pesquisadores avaliaram e analisaram a estabilidade do anticorpo terapêutico truzumab em 96 condições diferentes e concluíram o teste em 1,5 hora. Os resultados do teste são muito consistentes com os resultados da DSC. Se o equipamento de automação de laboratório for integrado, a triagem de milhares de amostras pode ser realizada todos os dias.
A curva de fusão do DSF mostra duas regiões de transformação separadas, que são adaptadas aos dados por meio de multiplicações mínimas de dois para determinar os valores de Tonset, Tm e enthalpia de van der Waal (AA A A A, B). A Figura 3 (a, b) mostra as curvas de fusão e os gráficos de adaptação dos auxiliares que perturbam/aumentam a estabilidade, respectivamente. A Figura 4(a) lista todos os auxiliares que podem melhorar a estabilidade dos anticorpos (em comparação com a amostra de controle).
O SUPR-DSF identificou corretamente os efeitos estabilizadores da histina auxiliar e do algoza usados no trutulzumab comercializado e, como mostrado na Figura 4 (b), os dados do SUPRDSF apresentam excelente confiabilidade e consistência, ao mesmo tempo que fornecem um fluxo surpreendentemente alto.
Obter parâmetros combinados com fluorescência de varredura diferencial de alto fluxo
A pesquisa analítica combinada é uma área-chave para o desenvolvimento de medicamentos, onde as características das interações e os valores de KD (constante de equilíbrio de desligação, caracterização da afinidade das ligações intermoleculares) são essenciais para a seleção de candidatos, e os pesquisadores precisam de abordagens complementares de vários princípios para triar e identificar milhares a dezenas de milhares de compostos de pequenas moléculas na biblioteca.
A análise de interações moleculares com o SUPR-DSF, independente de fatores como efeitos de superfície, transporte de massa ou problemas de refração do tampão, fornece medições de alto fluxo sem marcação dentro de uma faixa de concentrações de ligação do analítico.
Detectando mudanças na estabilidade do complexo proteína-ligando, pode ser usado para confirmar a especificidade da ligação; O valor de KD pode ser calculado através da variação do espectro de emissão de fluorescência durante a deformação térmica e a relação funcional da concentração do ligante. Mesmo para moléculas de ligação muito fracas, as mudanças de estabilidade induzidas pela ligação podem ser detectadas pelo SUPR-DSF.
Usando uma placa de microporos 384 padrão, a estabilidade de milhares de amostras pode ser filtrada em um dia para confirmar o estado de ligação.
Usando ligantes de estudo SUPR-DSF (TFMSA) em combinação com a anhidrase humana I, a curva de fusão da anhidrase varia com a concentração de TFMSA como mostrado na Figura 6.
A Figura 7 mostra a relação entre o valor Tm da carbonanidridase humana I e a concentração de TFMSA, com dois valores de KD obtidos, 2,1 μM e 174,2 μM, respectivamente.
Os valores consistentes na literatura demonstram que o SUPR-DSF pode ser usado como uma ferramenta de pré-triagem ou confirmação para estudos de ligando e é sensível.
Software intuitivo e simples
O software SUPR-DSF oferece funcionalidades intuitivas, simples, inteligentes e eficientes de design experimental e análise de dados que permitem aos iniciantes começar rapidamente e oferecem uma variedade de opções avançadas para usuários experientes e veteranos.
Sobre a ProteinStable
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