Colorante fluorescente para estrutura de tecido local HistoBright

Colorantes fluorescentes para visualização de estruturas de tecidos locais

HistoBright

HistoBright é um colorante fluorescente de membrana ambientalmente responsivo que permite a estimulação de dois fotões, com excelente permeabilidade de tecido e altera as propriedades fluorescentes de acordo com a estrutura local do tecido, permitindo, portanto, uma visualização de tecido de alto contraste. Combinado com o tratamento de transparência de tecido e o microscópio a laser de dois fotões, permite uma observação profunda e análise estrutural espacial de blocos de tecido.

※Este produto é baseado em pesquisas realizadas pela Universidade de Kochi e pela Universidade de Ehime e é produzido e vendido pela Funakoshi.

※Este produto é apenas para uso de pesquisa e não pode ser usado para fins diferentes da pesquisa.

HistoBright é um corante fluorescente responsivo ao ambiente que mostra uma ampla gama de comprimentos de onda de acordo com a polaridade do solvente. Quando aplicada a tecidos tratados com transparência, a fluorescência muda em resposta ao microambiente dentro do tecido e, posteriormente, combinada com a luz dupla.O microscópio a laser pode observar claramente a estrutura do tecido.

Métodos tradicionais de análise de estrutura organizacional e novos tipos de análise de estrutura organizacional 3D

A análise tradicional da estrutura de tecido é realizada por meio de corantes coloridos para a coloração do tecido, como a coloração de Sumicin-Irred (HE). E o uso desses corantes coloridos é difícil de tingir todo o tecido, geralmente é necessário fazer uma fatia fina depois de ser observado. Mas as fatias finas podem perder facilmente informações tridimensionais sobre a estrutura do tecido, por isso é necessário preparar uma grande quantidade de fatias para reproduzir a estrutura tridimensional.

HistoBright é um novo tipo de corante fluorescente responsivo ao ambiente sintetizado pelo Dr. Yoko Niso, do Departamento de Pesquisa Educativa da Universidade de Kochi (o composto no artigo original é chamado de PC), atualmente promovido pelo Dr. Kenshi Imura, Dr. Seiki Murakai e Dr. Ryuke Kawamei, do Departamento de Medicina da Universidade de Ehime, para o desenvolvimento de corantes de imagem fluorescente aplicados às estruturas de tecidos 3D. HistoBright se agrupa na biopelícula e, dependendo do ambiente local em que se encontra, a fluorescênciaLuz verde~Infravermelho próximomudanças em grande escala. Assim, quando HistoBright é aplicado a tecidos biológicos, ele pode induzir mudanças na tonalidade da fluorescência de acordo com a estrutura do tecido, permitindo assim observar a estrutura do tecido com alto contraste. Como o HistoBright é capaz de realizar excitação de dois fotões, além do microscópio de confocalização a laser, a observação pode ser feita com um microscópio a laser de dois fotões. Além disso, em combinação com o tratamento de transparência do tecido (além do método de manter a estrutura da membrana para a operação de desgordura), o HistoBright permite a observação de amostras de tecido espessa sem destruir a estrutura do tecido (sem preparar cortes finos) e a análise estrutural tridimensional do tecido por imagem profunda através de microscópio a laser de dois fotões.

◆ Características

Reagentes de coração de membrana responsivos ao ambiente, que podem ser mostrados de acordo com o ambiente circundanteLuz verde~Infravermelho próximopropriedades fluorescentes. Enlace de tecido local de alto contraste através da distinção das faixas de comprimentos de onda fluorescentes que precisam ser detectadas

Visualização estrutural.

●Combinado com a transparência de tecidos sem desgordura (como RapiClear (SunJin Lab), LUCID, etc.), permite uma análise 3D profunda da estrutura organizacional.

●* O uso de surfactantes (Triton X-100, Tween 20, etc.) dissolve a membrana lipídica no tecido e pode afetar a coloração do HistoBright, por isso não é recomendado. Para uso, discuta as condições aplicáveis.

●As observações podem ser feitas com um microscópio confocal a laser (luz de excitação recomendada: laser de 488 nm) ou um microscópio a laser de dois fotões (luz de excitação recomendada: laser de 960 nm).

●Quando observado com um microscópio a laser de dois fotões, as fibras de colágeno no tecido não tingido podem ser observadas com o uso de imagem de harmônia secundária (SHG).

●A coloração HE pode ser realizada após a coloração e observação com HistoBright.

◆ Texto original

Inoue, K.,et al., J. Mater. Química.B.,10(10), 1641～1649 (2022). Síntese e propriedades fotofísicas de um novo corante pirénico push-pull com emissão verde a vermelho distante e sua aplicação à imagem celular humana e de tecidos da pele. [PMID:35194628]

• Princípios

Espectro de excitação/emissão

HistoBright é um corante fluorescente solvatocrômico responsivo à polaridade do solvente que altera as propriedades fluorescentes de acordo com a polaridade molecular do solvente. Dependendo da polaridade do solvente, a fluorescênciaverde(baixa polaridade)Infravermelho próximoMudanças significativas no âmbito da (alta polaridade).

Alterações no espectro fluorescente no modelo de membrana lipídica

HistoBright mostra alta afinidade com a membrana lipídica e apresenta diferentes propriedades fluorescentes de acordo com a fase da membrana lipídica. Ao contrário dos valores máximos de fluorescência nos lípidos do modelo de fase ordenada Lo (fosfolipidos de casco (SM) / colesterol (Chol)), os comprimentos de onda máximos nos lípidos do modelo de fase desordenada Ld (DOPC) também foram transferidos para uma faixa de comprimentos de onda longos de cerca de 30 nm, e a produtividade quântica de fluorescência também caiu de 0,72 (SM / Chol) para 0,37 (DOPC).

* Os dados de espectroscopia de fluorescência acima são fornecidos pelo Dr. Yosuke Rinko da Universidade de Kochi.

◆ Dados de aplicação

Imagem de tecido normal da pele humana transparente com microscópio laser de dois fotões

Após o uso de 4% de paraformaldeído / PBS para fixar os blocos de tecido normal da pele humana, prepará-los em cortes de 500 μm, ao mesmo tempo que 76 h de tratamento de transparência de tecido (LUCID) e HistoBright (10 μM) mancha. Através de um microscópio a laser de dois fotões, os blocos de tecido são excitados com laser a 960 nm, respectivamente a 492 nm (SHG:Azul）、500-550 nm（verde）、560~593nm（laranja(593-690 nm)VermelhoObtenha imagens fluorescentes separadamente e faça as seguintes quatro imagens sintéticas.

※ 492 nm（AzulSinais SHG provenientes de fibras de colágeno no tecido, em vez de sinais fluorescentes provenientes de fontes HistoBright.

Em seguida, imagens de 500 μm foram tiradas continuamente com um microscópio a laser de dois fotões na direção do eixo Z a um intervalo de 5 μm e uma construção tridimensional foi realizada usando software de análise de imagem para visualizar a estrutura fina do tecido da pele humana de forma tridimensional.

Imagem 3D de tecido normal da pele humana transparente com microscópio laser de dois fotões

Após a utilização de 4% de paraformaldeído/PBS para fixar os blocos de tecido normal da pele humana, prepará-los em cortes de 1 mm, ao mesmo tempo que o tratamento de transparência de tecido (RapiClear, SunJin Lab Inc.)*, HistoBright (10 μM) e coração nuclear (Hoechst33342) durante 72 h. Através do microscópio a laser de dois fotões, a excitação do tecido com o laser a 1100 nm, respectivamente a <492 nm (SHG:Azul）、500~550 nm（verde）、560~593 nm（laranja(593-690 nm)VermelhoObtenha imagens fluorescentes separadamente e faça as seguintes quatro imagens sintéticas. Com base nas condições acima, a fotografia contínua na direção do eixo Z a um intervalo de 5 μm foi construída em 3D usando o software de análise de imagem para animar os dados contínuos.

* O bloco de tecido no experimento foi fixado sem tratamento de membrana, tratamento de transparência direta e coloração.

Veja o vídeo completo: labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1646.html

Repetido para coloração HE

Use HistoBright para tingir e observar blocos de tecido celular normal da pele humana, colocando-o em PBS para remover o reagente de transparência. Em seguida, prepare a fatia fina para a coloração HE. Uma coloração clara de HE ainda pode ser realizada após a confirmação da coloração HistoBright.

Observação da coloração com microscópio a laser confocal e microscópio a laser bifotônico

Após o uso de 4% de paraformaldeído / PBS para fixar os blocos de tecido normal da pele humana, prepará-los em cortes de 0,5 mm durante 72 h de transparência de tecido (RapiClear, SunJin Lab)* e coloração HistoBright (10 μM). Em seguida, as observações foram feitas com um microscópio a laser confocal (esquerda: laser de 488 nm excitado) e um microscópio a laser de dois fotões (direita: laser de 960 nm excitado). Embora as duas imagens não tenham distinções significativas, o sinal SHG (fibra de colágeno) estimulado por dois fótons pode ser observado sob um microscópio a laser de dois fótons.

* O bloco de tecido no experimento foi fixado sem tratamento de membrana, tratamento de transparência direta e coloração.

* Os dados das imagens acima são fornecidos pelo Dr. Rysuke Kawamura da Universidade de Ehime.

◆Lista de produtos