One Step Seamless Cloning Kit (em inglês)

NobeladeOne Step Seamless Cloning Kit (em inglês)

Kit de clonagem sem costura de um passo (Seção única)

Número de catálogo:42111

Quantidade de embalagem:

Armazenamento de produtos:-20°C Conservar para evitar congelamento repetido

Os parâmetros de um produto específico dependem dos parâmetros da descrição do produto recebida

Descrição do produto:Kits de clonagem sem problemas de um passo não dependem deT4Enzimas de ligação, não limitadas pelo ponto de corte enzimático do veículo e do fragmento de destino, mas diretamente com o método de recombinação de fragmentos sobrepostos, com uma combinação enzimática especial que pode linearizar o veículo após qualquer método e com suas duas extremidades16-25bpÁreas sobrepostasPCRReorganização direcional de conexões, pode30Realizado em minutosAextremo ou extremo planoPCROs fragmentos de produto direcionam de forma eficiente a clonagem perfeita para qualquer local do veículo.

Características do produto:

1. 30minutos pode ser umPCR de 50bp-15kbAmpliação do segmento (plano)/ ATerminal) Clone inserido em qualquer lugar de qualquer veículo.

2.Disponibilidade de ponto de corte enzimático independente de veículos e fragmentos inseridosterminais pacíficos/粘性末端的限pode ser clonada em qualquer local.

3. Para uma clonação perfeita, os pontos de inserção não introduzem sequências de bases indesejadas.

4. Não depende de conectase e fosfatase, eficiente, preciso, taxa de clonagem positiva alcançada95%acima.

Esquema do princípio do kit de clonagem perfeita em um passo:

Carreiras lineares e inserçãoDNAPreparação do segmento:

APreparação de veículos lineares

(1).Fontes enzimáticas:O veículo linear obtido pela corte enzimático, a extremidade plana ou a cola, a corte monoenzimático ou a corte bienzimático podem ser recuperados após a corte enzimático.

NOTA: Nenhuma dupla cadeia dentro do sistema de reação de clonagem sem problemasDNAEnzimas de ligação, não ocorre a auto-ligação do veículo. Assim, mesmo os veículos lineares preparados por corte monoenzimático não necessitam de desfosforização final. Clonagem falsamente positiva após a conversão do produto recombinante(Nenhuma seção inserida)É formado pela transformação de veículos anelares não lineares de corte enzimático incompleto quantum. Recomendamos que a recuperação de cola pós-corte enzimático reduza essa proporção de veículos não lineares ao máximo.

(2).InversoPCRFonte:Recomendado o uso de alta fidelidadeDNAPolimerase (número:P517-05ouP812-05Preparação, se uma única faixa de ampliação pode passarPCRPurificação do produto (número:DC012-50Obter o veículo, caso contrário, através de cola reciclada (número de mercadoria:DC011-50)obtenção de transportadores.

Nota: InversoPCROs modelos plasmídicos também são portadores não lineares e também podem levar a clonagem falso positivo (sem fragmentos inseridos), portantoPCRCarreiras lineares de origem (PCRProduto) antes da purificaçãoDpn IModelo de plasmidos digestivos endocutâneos que podem reduzir o fundo e aumentar a taxa positiva. Mas, em geral, a recuperação de cola é suficiente para reduzir essa proporção de veículos não lineares ao máximo di, e, portanto, inversamente.PCRFonte de veículos lineares Nós também recomendamos a recuperação de cola.

B: InserirDNAPreparação do fragmento

(1).O princípio geral do projeto de precursores clonados sem problemas em um passo é:5’Introdução de sequências homogênicas terminais de veículos clonados lineares, permitindo a inserção de fragmentos de amplificação do produto5’e3’Sequências coerentes com terminais completos correspondentes aos dois extremos do veículo clonado linear, respectivamente(16 pontos de base)～20 pontos de base)。

(2).Desenho de primeiros de fragmento inserido: os primeiros clonados incluem sequências de primeiros específicos de fragmento inseridos e sequências sobrepostas.

Clone de precursores positivos(5’-3’): Carreira linear em direção16-25 ntSequência de zonas sobrepostas(3“A partir do final)+Inserir sequência de precursores específicos em sentido positivo do fragmento (18-25 nt）

Clone de Primário Reverso(5’-3’): Carreira linear inversa16-25 ntSequência de zonas sobrepostas(3“A partir do final)+Inserir sequência de precursores específicos inversos de fragmentos (18-25 nt）

Nota: pelo menos o número de bases das áreas sobrepostas16 pontos de basee entre várias áreas sobrepostas.TmOs valores devem ser consistentes e60°C (par AT = 2°C e par GC = 4°C)Caso contrário, o número de bases pode ser prolongado até que os requisitos sejam cumpridos.

De acordo com a estrutura da extremidade do transportador linear (5“Destacar,3' saliente, extremo plano), o design de introdução também dividido3As situações indicam o seguinte:

As duas extremidades do veículo linearizado devido ao modo linear (como corte monoenzimático, corte bienzimático, inverso)PCRDiferentemente, pode ser uma combinação arbitrária de duas ou duas das três estruturas finais acima, o princípio de design específico do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho do desenho.

Ao calcular a temperatura de ignição do protótipo amplificado, basta calcular a sequência de amplificação genética específica.TmValores, a sequência homogênica do terminal do veículo não deve participar do cálculo.

(3).Escolha de enzimas: recomendado o uso de alta fidelidadeDNApolimerase oumistura PCR(Número de mercadoria:P517-05ouP814-05）。

(4).Condições de reação: geralmente de acordo com as instruções específicas da polimerase usada.

(5).Purificar o segmento de inserção

l Opcional: se o fragmento for derivado de um modelo de plasmido e o plasmido tiver a mesma resistência que o veículo recombinante, use antes da purificaçãoDpn IModelo de plasmidos digestivos endocutâneos que reduzem o fundo e aumentam a taxa positiva.

l Se o segmento for único, recomenda-sePCRKit de purificação do produto (número:DC012-100(Fragmentos de purificação.

l Se houver amplificação não específica, recomenda-se a recuperação do kit com cola (n.º:DC011-100)reciclagem de fragmentos.

l Usando este método de clonagem, o ponto de corte enzimático usado para linearizar o veículo vai faltar no momento da junção, se houver requisitos estritos para o ponto de corte enzimático, recomenda-se prestar atenção à seleção do ponto de corte enzimático, se necessárioA sobreposição entre as sequências de regiões de precursores de clonagem positiva e inversa e as sequências de genes específicosAumente a base perdida para restaurar o local enzimático original (veja o exemplo abaixo).

l Se os plasmídeos recombinantes forem usados ​​para a expressão de proteínas, preste atenção à caixa de leitura do código, à sequência necessária para a expressão de proteínas e purificação (por exemplo, promotores,RBSSequências, códons iniciais, códons terminais, etiquetas de proteínas, etc.) não são destruídos.

Exemplo de design de introdutor positivo (EcoR Icorte enzimático):

Como mostrado acima, o transportadorEcor IEnzimas cortadas, formadas5Destacar o final:

De acordo com os princípios de concepção acima, a partir de3Começar a calcular, voltar16bp-25bp(Este exemplo é usado20 bpOs extremos sobrepõem-se à mesma sequência) antes de adicionar a sequência de precursores específicos do segmento de destino. Garantir a sobreposição de áreasTmValores consistentes e60°C (par AT = 2°C e par GC = 4°C)。

Os primeiros positivos são os seguintes:5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNN3'

Nota: Após a conclusão da conexão de clonagem do desenho inicial acima,EcoR IO ponto de corte enzimático desaparecerá (o ponto de corte enzimático não será mantido).

Se necessário reservarEcoR IPonto de corte enzimático necessário na extremidade do veículo20 bpComplementação ausente entre a sequência de sobreposição e a sequência de precursores específicos do segmento de destinoEcoR ISequência de locais de identificaçãoAttcApós a conexão clonada,EcoR IO ponto de corte enzimático permanece presente (retenção do ponto de corte enzimático).

Especificamente:5' GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3'

Exemplo de design de introdutor inverso (Hind IIIcorte enzimático):

Como mostrado acima, o transportadorHind IIIEnzimas cortadas, formadas5Destacar o final:

De acordo com os princípios de concepção acima, a partir de3Começar a calcular, voltar16bp-25bp(Este exemplo é usado20 bpOs extremos sobrepõem-se à mesma sequência) antes de adicionar a sequência de precursores específicos do segmento de destino. Garantir a sobreposição de áreasTmValores consistentes e60°C (par AT = 2°C e par GC = 4°C)。

Os primeiros inversos são os seguintes:5'CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Nota: Após a conclusão da conexão de clonagem do desenho inicial acima,Hind IIIOs pontos de corte desaparecerão (o ponto de corte enzimático não será mantido).

Se necessário reservarHind IIIPonto de corte enzimático necessário na extremidade do veículo20 bpComplementação ausente entre a sequência de sobreposição e a sequência de precursores específicos do segmento de destinoHind IIISequência de locais de identificaçãoagctt，Hind IIIO ponto de corte enzimático permanece presente (retenção do ponto de corte enzimático).

Especificamente:5' CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Etapas operacionais para uma reação de clonagem perfeita:

Atenção:2 × mistura de clonagem OneStepContém um reforçador de conexãoPEGMuito viscoso, a baixa temperatura do frigorífico é mais viscoso, pode ser colocado no congelamento das mãos por alguns minutos para aumentar a temperatura pode reduzir a viscosidade (sem afetar a qualidade), mistura de balas leves, coleta instantânea centrífuga para o fundo do tubo.

1. Crie um sistema de reação de acordo com a tabela abaixo (pode ser usado)PCRTubo preparado a temperatura ambiente)

* Utilização Geral do Transportador20-50 ngInserir o fragmento com o mórbio do transportador em2:1-3:1entre os melhores; Se o segmento for menor que200bpInserir o segmento com a molar do transportador5:1。

2. Misturar suavemente, em50°CReação15minutos (disponíveis)PCRno instrumento), após a reaçãoPCRTransformação ou conservação direta após colocação no gelo-20°Cfragmentos mais curtos, por exemplo.100bp-1kbSó preciso.15Convertidores suficientes podem ser obtidos em minutos e conexões de segmentos mais longos podem prolongar o tempo de reação até60Um minuto.

3. 取5 μlOs produtos da reação são transformados de acordo com as instruções das células do estado sensorial (se houver menos transformadores, todos os produtos podem ser transformados e todo o líquido de conversão revestido).

Identificação de clonagem positiva:

Colônias podem ser escolhidas de acordo com as circunstânciasPCRIdentificação, extração de plasmidos (número de mercadoria)31013-100Identificação enzimática restritiva ou identificação de sequência.

One Step Seamless Cloning Kit (em inglês)