Serviço de Experimento de Electróforese bidirecional de proteínas

Um,Serviço de Experimento de Electróforese bidirecional de proteínasIntrodução Técnica Experimental

2D-WB é uma técnica que combina a eletroferese bidirecional com o Western Blot tradicional. Processo experimental geral A mistura de proteína de antígeno é separada pela eletroferese bidirecional e, em seguida, a proteína de gel é transferida para a membrana de suporte e colorida por meio de cruzamento de anticorpos. A tecnologia 2D-WB pode detectar pequenas mudanças no isoponto de antígeno ou no peso molecular e tem boas aplicações no estudo da modificação pós-tradução de proteínas; O 2D-WB combinado com a espectroscopia de massa permite encontrar antígenos mais imunogênicos em misturas de proteínas.

Dois.Serviço de Experimento de Electróforese bidirecional de proteínasVisão geral

2D-WB é uma técnica que combina a eletroferese bidirecional com o Western Blot tradicional. Processo experimental geral A mistura de proteínas de antígeno é separada pela eletroferese bidirecional e, em seguida, a proteína de gel é transferida para a membrana de suporte e colorida por meio de cruzamento de anticorpos. A tecnologia 2D-WB pode detectar pequenas mudanças no isoponto de antígeno ou no peso molecular e tem boas aplicações no estudo da modificação pós-tradução de proteínas; O 2D-WB combinado com a espectroscopia de massa permite encontrar antígenos mais imunogênicos em misturas de proteínas.

III. Conteúdo do serviço

Extração e quantificação de proteínas;

2. eletroforese bidirecional;

3, transfiguração, fechamento, incubação, exibição de imagem.

IV. Processo de operação experimental

1 - Item eletroforese (IEF), equilíbrio de barra de cola, segundo item eletroforese SDS-APGE.

2, após o fim da segunda eletroferese, remover o gel para a transferência de membrana, o método de transferência de membrana pode escolher a transferência úmida e a transferência semi-seca. As membranas mais usadas são NC e PVDF.

Fechado, 5% de leite em pó desgorduroso ou 5% de BSA fechado por 1 hora (temperatura ambiente) ou durante a noite (4 graus).

4, um anti-incubação, de acordo com as instruções de anticorpos para escolher o tempo de incubação, as condições de incubação habituais são a temperatura ambiente por 1 hora ou 4 graus durante a noite, um anti-incubação após a retirada da membrana

TBST lavar 3 vezes por 5 minutos cada vez.

Segunda incubação anti: de acordo com a seleção de um anti-secundário apropriado (anti-ratos, anti-humanos, anti-coelhos, etc.), após a incubação em temperatura ambiente de 1 hora, retirar a membrana TBST lavar 3 vezes, cada vez por 5 minutos.

6, exibição: diluição proporcional do substrato A, B mescla uniformemente gotejando sobre a membrana, na câmara escura colocar o filme sobre a membrana, cobrir o clipe de prensa, depois de um certo tempo de exposição, o filme é colocado no líquido de exibição para exibição, até que apareça uma faixa de proteína clara, lavagem de água limpa após a definição no líquido de exibição, o tempo de exposição precisa considerar a quantidade de amostra superior de proteína, a concentração de diluição de anticorpos, o tempo de incubação de anticorpos e outros fatores.

Após a imagem, limpe o filme, seque, marcador de calibração, imagem de digitalização e análise de imagem de Western blot 2D.

Para garantir que o serviço de tecnologia 2D Western blot possa ser realizado sem problemas, o envio de amostras deve atender aos seguintes requisitos:

1, o cliente fornece: tecidos, células, soluções de proteínas, etc.; Uma resistência (pode ser entregue pela empresa de pesquisa).

Requisitos de transporte: embalagem de gelo seco ou nitrogênio líquido.

Nota: As amostras devem evitar todos os tipos de poluição e congelamento repetido.

Conteúdo do relatório de serviços técnicos

Resultados de quantificação de proteínas e quantidade de amostras em eletroferese;

Filmes originais, imagens eletrônicas e resultados de análise de imagens;

2D Western blot relatório completo do experimento, incluindo as etapas do experimento, uso de instrumentos e reagentes, etc.

Experimentação de Western Blot 2D

Preparação de amostras de proteínas de Western blot 2D, o principal princípio da preparação é dissolver todas as proteínas, destruir a interação entre proteínas e proteínas, evitar vários tipos de substâncias interferentes, a preparação de amostras é compatível com o IEF, etc.

2, as principais etapas de eletróforese bidirecional, o primeiro item elétrico (IEF), o equilíbrio de cola, o segundo item de eletróforese SDS-APGE.

3, após o fim da segunda eletroferese, remover o gel para a transferência de membrana, o método de transferência de membrana pode escolher a transferência úmida e a transferência semi-seca. As membranas mais usadas são NC e PVDF.

4, fechado, 5% de leite em pó degrassado ou 5% BSA fechado por 1 hora (temperatura ambiente) ou durante a noite (4 graus).

5, anti-incubação, de acordo com as instruções de anticorpos para escolher o tempo de incubação, as condições de incubação habituais são a temperatura ambiente de 1 hora ou 4 graus durante a noite, um anti-incubação após a retirada da membrana TBST lavar 3 vezes, cada vez por 5 minutos.

6, anti-incubação secundária: de acordo com a anti-seleção do anti-secundário apropriado (anti-rato, anti-coelho anti-humano, etc.), a temperatura ambiente após a incubação de 1 hora para remover a membrana TBST lavar 3 vezes, cada vez por 5 minutos.

7, exibição: diluir proporcionalmente o substrato A, B misturado uniformemente depois de gotear na membrana, na câmara escura colocar o filme na membrana, cobrir o clipe de prensa, depois de um certo tempo de exposição, colocar o filme no líquido de exibição para exibição, até aparecer uma faixa de proteína clara, lavar com água limpa depois de definir no líquido de exibição, o tempo de exposição deve considerar a proteína. Quantidade de amostra, concentração de diluição de anticorpos, tempo de incubação de anticorpos e outros fatores.

Após a imagem, limpe o filme, seque, marcador de calibração, imagem de digitalização e análise de imagem de Western blot 2D.

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