Kit de teste de conversão do fator de crescimento beta (TGF-beta) elisa do peixe zebra Pesquisa científica

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Composição do Kit ELISA

Kits de ELISA geralmente contêm os seguintes componentes-chave, e os diferentes tipos de kits (por exemplo, clamping, métodos indiretos, etc.) podem variar ligeiramente:

1. Placa de embalagem: a capa de superfície é composta por 96 buracos (principalmente poliestireno) com anticorpos específicos (ou antígenos) para capturar moléculas alvo na amostra.
2. Produtos padrão/calibrados: moléculas alvo com concentrações conhecidas (por exemplo, antígenos recombinantes, anticorpos purificados) são usadas para traçar curvas padrão para quantificar a concentração de moléculas alvo na amostra.
3. Detecção de anticorpos: anticorpos específicos para a molécula alvo (muitas vezes marcados com enzimas, como a peroxidase de raigem HRP, fosfatase alcalina AP).
4. Dilução de compostos enzimáticos: tampão usado para diluir anticorpos marcados por enzimas.
5. Solução de substrato: substrato catalizado por enzimas (por exemplo, líquido de coloração TMB correspondente ao HRP, líquido de coloração OPD); AP corresponde ao líquido colorido PNPP), após a reação para gerar um produto colorido.
6. Terminar líquido: terminar a reação enzimática e fixar o resultado de coloração.
7. Liquido de lavagem (PBST ou TBST): usado para lavar substâncias não específicas não ligadas, reduzindo a interferência de fundo.
8. Liquido fechado: o pacote é fechado após a placa microporosa não ligado ao local para evitar a adsorção não específica.
9. Liquido de diluição da amostra: usado para diluir a amostra a ser testada (por exemplo, soro, plasma, homologação de tecido, etc.) para combinar o sistema de reação.

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Princípio do teste ELISA

O núcleo do ELISA é a ligação específica antígeno-anticorpo com a ligação à reação de coloração enzimática, com as principais etapas a seguir (usando a "centrifugação" como exemplo):

1. Envoltura: Envoltura de anticorpos específicos (anticorpos de captura) na superfície da placa microporosa para formar anticorpos de fase sólida.
2. Fechamento: adicionar líquido fechado para preencher os locais não ligados aos anticorpos para evitar a adsorção não específica das proteínas híbridas na amostra.
3. Amostragem: Adicione uma amostra a ser testada (com antígeno alvo) ou um produto padrão, e o antígeno na amostra se liga ao anticorpo de fase sólida.
4. Incubação com lavagem: incubar a temperatura ambiente ou 37 ° C para que o antígeno-anticorpo se ligue completamente; A lavagem elimina as substâncias não ligadas.
5. Adicionando anticorpos de detecção: Adicionando anticorpos de detecção marcados por enzimas (ligando-se a outro epitopo do antígeno alvo) para formar um complexo "anticorpo de fase sólida-antígeno-anticorpo marcado por enzimas" (estrutura de clamp).
6. Lavar novamente: remover os anticorpos enzimáticos não ligados.
7. Coloração do substrato aditivo: Adicionando a solução do substrato, enzimas (como HRP) catalisam o substrato para produzir produtos coloridos (a clareza da cor está positivamente relacionada com a concentração de antígeno alvo).
8. Terminar a reação: Adicione um líquido terminante (por exemplo, ácido sulfúrico) para parar a reação de coloração.
9. Análise de leitura: Medir a absorção (OD) em comprimentos de onda específicos (por exemplo, HRP correspondente a 450 nm) com um escalómetro enzimático, calculando a concentração do antígeno alvo na amostra por meio de curvas padrão.

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Principais tipos de ELISA

Dependendo do alvo de teste (antígeno / anticorpo) e do princípio da reação, o ELISA pode ser dividido em as seguintes categorias:

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IV. Precauções operacionais

Para garantir a precisão e repetibilidade dos resultados do teste, é necessário prestar atenção aos seguintes pontos-chave:

1. Tratamento de amostras: evitar interferências de hemolisis, lipoase ou isotismas; As amostras devem ser diluídas de acordo com as instruções.
2. Temperatura: Controle rigorosamente a temperatura (geralmente 37 ° C) e o tempo (30 minutos a 2 horas) para evitar flutuações de temperatura ou tempo insuficiente / excessivo.
3. Operação de lavagem: lavagem insuficiente pode levar a fundo alto, lavagem excessiva pode lavar os compostos; Recomenda-se o uso de uma máquina de lavar louça (configurar 5 lavagens por 30 segundos cada vez).
4. Controle de exibição de cor: o substrato deve ser mantido à luz e o tempo de exibição de cor deve ser ajustado de acordo com a concentração da amostra.
5. Configurações de controle: Controle em branco, controle negativo, controle positivo e produtos padrão devem ser definidos para validar a validade do experimento.

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Controle de qualidade e interpretação dos resultados

1. Curva padrão: Use a concentração do produto padrão como coordenada horizontal, o valor de OD como coordenada longitudinal, desenhe a curva padrão (geralmente curva tipo S), calcule a concentração correspondente ao valor de OD da amostra (atenção à gama linear, além da gama, diluição ou concentração da amostra é necessária).
2. Sensibilidade e especificidade: a sensibilidade (baixo limite de detecção zui) e a especificidade (taxa de resposta cruzada com análogos) são os principais indicadores para avaliar o desempenho da caixa de ensaio, que requerem referência ao manual ou validação pré-experimental.
3. Validade dos dados: se a curva padrão R² for < 0,99, o valor de OD do controle negativo for excessivamente alto (> 0,1) ou o controle positivo não atingir o padrão, o experimento deve ser novamente realizado.

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6. Área de aplicação

• Área de pesquisa científica: somente para pesquisa científica.

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Recomendações para escolher o kit ELISA

• Detecção clara do alvo: antígeno (como proteína viral) ou anticorpo (como IgG/IgM)? As moléculas pequenas (como medicamentos) devem ser selecionadas em kits de competição.
• Tipo de amostra: soro, plasma, homoplasma ou soro supracelular? É necessário escolher a diluição da amostra correspondente.
• Requisitos de desempenho: a detecção quantitativa deve prestar atenção ao alcance linear e à repetitividade; A detecção qualitativa concentra-se na definição do valor crítico (Cut-off).

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