Kit de clonagem simples TOPO-TA/Blunt Lightning

NobeladeKit de clonagem simples TOPO-TA/Blunt Lightning

TOPO-TA Blunt Kit de Clonagem Simples Lightning

Número de catálogo：42212

Conteúdo do produto:

Condições de conservação:

-20℃, armazenamento12 meses sem afetar o efeito do uso.

Descrição do produto:

A clonação TA ou Blunt pode ser concluída em 20 minutos a temperatura ambiente, com taxas positivas próximas de 100%, e sem banho de gelo, excitação térmica, triagem livre de manchas azuis e brancas, e até 10 kb de fragmentos de DNA podem ser ligados.

Passos de clonagem(≤3kb de seção)：

Passos simplificados(≤10kb) Segmento） Sem reanimação, sem líquidos. LB

Conexão: Temperatura ambiente 5 minutos；

1 - Conexão: 37°C Conexão 5 min。

Transformação: salaQuente 5 Relógio；

Transformação: banho de gelo 5 min， 42 ° C quente 1 min， No gelo. 2 min。

Recuperação: 180 rpm, 37℃ Cultura de oscilação10 minutos; Painting.

Leve toda a placa de revestimento de bactérios e cultive a 37 ° C.

Passos operacionais:

1. PCRPreparação do produto:

a. Requisitos do precursor: o precursor não pode ser fosforizado.

b. Escolha de enzimas: escolha conforme necessárioDNA Polimerase, compatível com o veículoPCR do produtoA O fim da paz.

c. Detecção de eletrofóreseQuantidade e qualidade do produto de PCR:

① apenas faixa de propósito, pode realizar a reação de conexão direta, sem necessidade de purificação;

Se houver várias faixas, recomenda-se que o gel recupere o fragmento de DNA (DC011-100);

Se a expansão do plasmídeo for usada como modelo, a recuperação de gel deve ser realizada, porque o plasmídeo do modelo também crescerá colônias não destinadas.

2. Reação de conexão:

1） Temperatura ambiente (20 ° C-37 ° C) para estabelecer o sistema de conexão (10ul) Sistema）：

Doses recomendadas para segmentos de inserção de diferentes tamanhos:

Após a adição do reagente, misture o fundo do tubo (ou misture suavemente)）A centrifugação do ponto é levantada para recolher todos os líquidos no fundo do tubo de centrifugação.

2) Temperatura ambiente (20℃-37℃)Conexão5 Um minuto. Os produtos de conexão podem ser transformados diretamente nas células sensíveis ou colocados em reposição no gelo.

3. Transformação, recuperação, revestimento:

1）100ul Células sensíveis, colocadas a temperatura ambiente para descongelar (Aproximadamente1 minutos ou mais), esfregar levemente várias vezes para suspender as células uniformemente.

2） Inscrever10ul líquido de conexão, misturado suavemente, temperatura ambiente (20 ℃ -37 ℃)PosicionamentoCinco minutos.

3） Inscrever500ulEquilíbrio à temperatura ambienteLBOu...SOC Médio de cultura (sem antibióticos), 37℃180 rpmCultura de Oscilação10 min。

（Nota: maior do que3kb O tempo de cultura oscilante do segmento é prolongado para 30-60 Em minutos, o conversor pode ser aumentado. Ou com passos simplificados.）

4） 取200l Placa de revestimento microbiano (Contém ampericina qing50-100ug/ml）， cultivo durante a noite. (Para obter mais clonações, 4000 rpm Centrífuga1 min， Elimine a parte superior, mantenha100-150ul， Suspendência leve de bactérios, retirar toda a placa de revestimento de bactérios)

Atenção: se usado5ul O sistema, cada componente é reduzido à metade de acordo com a proporção, o número de vezes de uso pode ser duplicado.

4. Identificação de filtro do conversor:

A taxa positiva deste produto é bastante alta e, em geral, pode ser alcançado o que é visto como resultado, desde que a colônia que cresceu é normal (não contaminante).Géritos. O número de conversores não é muito pequeno.）Basicamente, inclui a inserção. Portanto, a inserção de fragmentos não excede2-3kb Em caso de não ser identificadoEscolha diretamenteSequência 1-2 bactérias.

1） ColôniasPCR Detecção: colônia selecionada em 10ul Em água estéril, misturar e tomar 1ulColocar em25ul PCR sistema,UsarO precursor de PCR ou o precursor genérico M13 para identificar clones positivos.

2）Use a sequência genérica M13F(-20)/M13R(-26) para determinar se o clone de destino é contido.

pTOPO-TA/Blunt (em inglês)Diagrama do transportador:

pTOPO-TA/Blunt (em inglês) Sequência de transportadores:

Kit de clonagem simples TOPO-TA/Blunt Lightning