Kit de clonagem rápida de extremo plano de fundo zero T4 veículo do princípio

Kit de clonagem rápida de extremo plano de fundo zero T4 veículo do princípio

Zero-BluntKit de clonagem rápida de extremo plano de fundo zero

Número de catálogo:42018

Composição, armazenamento e estabilidade:

Armazenamento a 20 ° C, não afeta o efeito do uso durante 6 meses.

Os parâmetros de um produto específico dependem dos parâmetros da descrição do produto recebida

v Introdução do produto:

O kit de conexão rápida de terminal plano de fundo zero é um excelente sistema de clonação de seleção positiva do gene autosha que pode clonar de forma eficiente produtos de PCR de terminal plano e qualquer fragmento de DNA com terminal plano. O kit é eficaz para fragmentos de DNA fosforilados ou não fosforilados. A seleção positiva do veículo e a conexão do segmento de inserção levam apenas 5 minutos para obter mais de 95% de clonagem recombinante positiva. Os produtos de PCR de extremo plano amplificados por uma polimerasa com atividade corretiva, como a polimerasa Pfu, podem ser ligados diretamente ao veículo clonal. Os produtos de conexão podem transformar diretamente as cepas comuns de E. coli.

Kit fornece um novo vetor de clonagem auto-sha seleção positiva pZERO-Blunt. O veículo contém o gene autosah letal (que contém um sítio multiclonal) e, quando o veículo é conectado com sucesso ao fragmento, o gene autosah não pode ser expresso corretamente e as células que contêm o recombinante podem crescer normalmente; Quando a ligação do veículo com o fragmento não é bem sucedida, o gene SHA do veículo se expressa corretamente após a ligação, e as células que contêm o veículo vazio não podem sobreviver, ou seja, o fundo "zero zero". Essa estratégia de triagem positiva não requer triagem de manchas azuis e brancas, acelerando drasticamente o processo de triagem de clonagem.

Para facilitar o mapeamento enzimático e a manipulação do gene de inserção de fragmentos, os locais multiclonais do veículo clonal pZERO-Blunt contêm uma sequência de identificação BglII em cada lado. Além disso, o veículo contém promotores T7 que podem ser usados ​​em estudos como transcrição in vitro ou in vitro, sequência de segmentos de inserção, etc.

Passos operacionais:

1. Preparação da reação de conexão:

Os produtos de PCR de extremo plano ou fragmentos de extremo plano pós-corte enzimático podem ser recuperados por separação por eletróforese em gel de aglutinosa (usando cola de corte sob luz ultravioleta de onda longa ou cola de corte com transmissão de luz visível para evitar danos ao DNA causando falhas de conexão). A relação de molécula com o veículo é de 3:1. Os kits de reciclagem de purificação rápida de produtos de DNA produzidos pela empresa são excelentes para a reciclagem de fragmentos de DNA acima de 70 bp.

2. Reação rápida de conexão:

1) Em um padrão de 10ml Conecte o sistema de reação, adicionando 1mL 40, <NUM>#1 do pzero-blunt Chml Produtos de PCR (em condições normais, não é necessário quantificar exatamente os produtos de PCR, a relação molar do produto de PCR e do veículo é otimizada para 1: 1 a 10: 1 para obter bons resultados, recomendado 3: 1, veja o apéndice)ml 2´Buffer de ligação rápida e 0.9ml T4 DNA Ligase, o resto é suplementado com água esterilizada.

A reação é realizada de acordo com o seguinte sistema:

A ligase de DNA T4 é adicionada.

2) 22 ° C conectar por 5-10 minutos (geralmente pode ser feito em um instrumento de PCR).

Geralmente, a conexão de 22 ° C é recomendada por 5-10 minutos, e a conexão de segmentos longos > 3kb pode ser prolongada até 30 minutos. Não é recomendado mais de 30 minutos, mais do que pode reduzir o número de conversores.

3) Resfriar no gelo e, em seguida, transformar ou armazenar a -20 ° C.

3. Conversão:

1) 100ml Células sensíveis, colocadas no gelo, depois de descongelar, suavemente lavar várias vezes para suspender as células uniformemente.

2) Junte-se 4-5ml Liquido de conexão (até tudo pode ser adicionado, desde que o volume do líquido de conexão não exceda 1/10 do volume das células sensíveis), misture suavemente. Deixe no gelo por 30 minutos.

3) 42 ° C banho quente durante 90 segundos. Deixe no gelo por 2 a 3 minutos.

4) Mais 500mL LB ou SOC meio (sem antibióticos), 37 ° C 150 rpm oscilação de cultura por 60 minutos.

5) Serão 200ml Bactérias revestidas em ampeliqing micina (100mg/ml) no comprimido.

A dose de bactéria revestida é ajustada adequadamente de acordo com a eficiência da conexão e a sensibilidade das células sensíveis, se menos clonação prevista, parte do líquido de cultura pode ser absorvida por centrifugação (4.000 rpm, 2 minutos), deixando a quantidade adequada de meio de cultura em suspensão de bactéria após a retirada total ou a quantidade moderada pode ser revestida em uma placa (o líquido restante revestido pode ser mantido em 4 graus e conservado no dia 2, se o número de colônias convertidas for menor, o líquido restante pode ser revestido em uma nova placa de cultura).

6) O comprimido é colocado em direção a 37 ° C por 1 hora para absorver o excesso de líquido e, em seguida, inverte a cultura durante a noite.

5 Filtração:

1). Teste de rotina: colônias serão vacinadas com 1-5 ml de LB (contendo uma concentração final de 100).mg / ml de ampeliqing micina) meio de cultura, 37 ° C oscilação do leito de agitação durante a noite, conservar a espécie após a extração do plasmídio, aplicar PCR ou método de corte enzimático para determinar se o fragmento inserido é correto.

2). Detecção rápida: colônias selecionadas para teste PCR direto (veja a versão 3 da Clonação Molecular ou refera-se ao manual CV05-Universal T Carrier Colony PCR Identification Kit da empresa).
3). Identificação de sequência: Sequência de um protótipo ou um sub-protótipo iniciador T7 com o kit para determinar se a clonação destinada é contida.

Este kit vem com um precursor de sequenciamento (também usado para a identificação de precursores por PCR em colônias):

v Anexo:

em Como calcular a quantidade de produtos de PCR necessários para a reação de conexão?

A proporção molar do produto de PCR e do veículo é otimizada para 1:1 a 10:1 (recomendado 3:1) para obter bons resultados, usando a seguinte fórmula:

[A quantidade de inserção do veículo (ng) × tamanho do segmento de inserção (kb) ÷ tamanho do veículo (kb)] × a proporção molar do segmento de inserção e do veículo = a quantidade do segmento de inserção (ng) Por exemplo: a proporção molar do segmento de inserção e da conexão do veículo é de 3:1, se a reação de conexão adicionar o veículo 40ng, o tamanho do segmento de inserção é de 500bp, então a quantidade do segmento de inserção deve ser adicionada como [40ng veículo × 0,5kb inserção do segmento ÷ 2,974kb veículo] × 3/1 = 20,2ng.

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