Kit de teste genético de relatório de bifluorosase

Kit de Ensaio Firefly & RenillaKit de teste genético de relatório de bifluorosasePara fornecer um meio eficaz para detectar a expressão de genes, no teste DLR, a atividade da luciferase de fogueira e da luciferase renal marinha podem ser detectadas em amostras individuais. Primeiro, a fluorescena (Luciferin) como substrato para detectar a atividade da fluorescenase de luciferas, em seguida, adicionar a substância que inibe a catálise da fluorescenase de luciferas, ao mesmo tempo que a coelenterazina é adicionada para detectar a atividade da fluorescenase renal marinha, para obter o teste genético de relatório de fluorescenase dupla. Através do sistema bioluminescente da fluorescenase e de seus substratos, a expressão de genes pode ser detectada de forma muito sensível e eficiente. Normalmente, o componente regulador de transcrição ou a sub-região iniciadora 5' do gene interessado é clonado a jusante da Luciferase, ou a região 3'-UTR é clonada a jusante da Luciferase, construída em plasmídeos do gene Reporter, em seguida, as células são transfectadas, as células são tratadas com medicamentos apropriados, etc. para determinar o efeito regulador de transcrição do tratamento de medicamentos sobre o gene alvo, detectando os altos e baixos da atividade da fluorescenase. A fluorosase renal marinha é mais usada como parâmetro interno para detectar a eficiência da transfecção, a fim de eliminar as diferenças no número de células e eficiência da transfecção.
A fluorescenase de luciferas é uma proteína com um peso molecular de cerca de 61 kD que, na presença de ATP, íons magnésio e oxigênio, cataliza a fluorescência para produzir oxido de fluorescência (Oxyluciferin), que produz sinais fotológicos durante a oxidação da fluorescência. A fluorosase renal marinha é uma proteína com um peso molecular de cerca de 36 kD que, em presença de oxigênio, cataliza a oxidação da coelentramida, que também produz sinais fotológicos durante a oxidação da coelentramida. O sinal óptico deste kit pode ser medido por meio de um luminômetro químico, um marcador enzimático ou um flash líquido. O kit tem características de detecção rápida, alta sensibilidade, ampla gama de detecção e nenhuma interferência da atividade endógena celular.
Características do produto:
Rápido: a fissão celular é concluída em 10-15 min.
Conveniente: os reagentes são fáceis de preparar e as etapas de detecção de amostras são simples.
Sensibilidade: Capaz de detectar zui baixo 10-20molar de fluorosase.
As concentrações de enzimas podem variar linearmente até oito séries de quantidade.
Composição do produto:

1. Divulgação celular
(1) Remover o meio de cultura e adicionar PBS para lavar suavemente duas vezes (as células de parede podem fazer isso diretamente, as células em suspensão precisam coletar as células por centrifugação). Adicione 1 x Lysis Buffer (pressione 4: 1 para diluir o componente A com água estéril) de acordo com o esquema abaixo e, em seguida, coloque a placa de cultura em um microoscilador para oscilar a temperatura ambiente por 15 min para dissolver completamente as células.
Nota: o produto de fissura pode ser conservado a temperatura ambiente por 6 h, -70 ° C pode ser armazenado a longo prazo (o produto de fissura não pode ser congelado repetidamente).
(2) Centrifugar o produto de fissura em 10.000-15.000 rpm por 3-5 min e transferir o líquido supernatante para um novo tubo EP para teste posterior após a centrifugação.
NOTA: As células podem ser detectadas imediatamente após a fissão ou podem ser congeladas e detectadas novamente quando necessário. As amostras congeladas devem ser derretidas a temperatura ambiente para serem testadas.
2. Preparação do líquido de trabalho
Restaure todos os componentes à temperatura ambiente.
(2) Use o componente B para dissolver completamente o componente C e preparar 0,2 mg/mL de líquido de trabalho de fluorescenase de fogo-fogo.
Nota: o líquido de trabalho da fluorescenase de fogueras não pode ser congelado repetidamente, se a dose experimental é menor, é recomendado dividir em pequenas especificações por uso único.
(3) Diluir o componente E no líquido de trabalho da fluorescenase renal marinha com o componente D, adicionando 1 ul de componente E ao componente D de 49 µL.
NOTA: O líquido de trabalho da fluorescenase renal marinha precisa ser equipado atualmente.
3, Detecção de luminosidade química
(1) De acordo com as instruções de funcionamento do instrumento, abra o instrumento com função de detecção de luminosidade química, como o calibrador enzimático multifuncional, defina os parâmetros, o tempo de medição é de 10 s e o intervalo de medição é de 2 s.
(2) Para cada medição da amostra, tome uma amostra de 20-100 ul (se o volume da amostra for suficiente, adicione 100 ul; se o volume da amostra for insuficiente, a quantidade pode ser reduzida adequadamente, mas a quantidade do buraco de detecção deve ser consistente). 1 x Lysis Buffer é o controle em branco.
(3) Adicione o líquido de fluorescenase de 100 ul para determinar o valor da unidade de luz relativa (recomenda-se que o calibrador enzimático defina a função de mistura de agitação).
NOTA: Como a luminosidade é instantânea, recomenda-se que o teste seja realizado imediatamente após a adição do líquido de trabalho da fluorescenase de fogueiras.
(4) Adicionar 100 ul do líquido de trabalho da fluorescenase renal marinha para determinar o valor da RLU (unidade de luz relativa) (recomenda-se que o calibrador enzimático defina a função de mistura de agitação).
(5) No caso de fluorescenase renal marinha como 参考a interna, o valor de RLU obtido com fluorescenase de fogueiras dividido pelo valor de RLU obtido com fluorescenase renal marinha. O nível de ativação do gene relatado entre diferentes amostras é comparado com base nos valores obtidos. Um cálculo semelhante pode ser feito se a fluorescenase de fogo-luzes for a 参考a interna.

Conservar a -20°C. O componente C recomenda a utilização prévia de água estéril configurada para armazenamento de 2 mg/mL, o componente B, o componente D e o componente C configurado para armazenamento,
Pequena partilha de acordo com as necessidades experimentais. Todos os fluidos de trabalho de teste são recomendados para uso atual para evitar o congelamento repetido.

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