Kit de teste de fluxo de cálcio celular sem lavagem Fluo-8 AM

Kit de teste de fluxo de cálcio celular sem lavagem Fluo-8 AMOs componentes e especificações estão abaixo. Recomenda-se o uso de reagente de carga de células Fluo-8 de 96 placas por poço de 100 μL, 384 placas por poço de 25 μL. Os 96T, 960T e 9600T podem realizar experimentos com placas de 1, 10 e 100 blocos de 96 ou 384 buracos, respectivamente.

De acordo com a necessidade experimental de vacinar as células em uma placa de cultura de células pretas transparentes no fundo de 96 ou 384 poços, a concentração sérica do meio de cultura celular não excede 10%. De acordo com a necessidade experimental 37 ° C 5% CO2Incubação caixa incubar por um certo tempo.
Retire o tampão de carga Fluo-8 e o reagente QF (10x), equilibre até a temperatura ambiente e misture completamente.
Retire o Fluo-8 AM, dissolva-se a temperatura ambiente, colete o conteúdo por centrifugação no fundo do tubo e coloque-o no gelo. Se o Fluo-8 AM não for usado de uma só vez, deve ser dividido e conservado à luz a -20 ° C para evitar o congelamento repetido.
Calcular a quantidade necessária de reagente de carga de células Fluo-8 por adição de cada poço e o volume de meio de cultura no poço
Formulação do reagente de carga celular Fluo-8: adicione o reagente 10x QF a 10 vezes diluído no tampão de carga Fluo-8, por exemplo, 1mL de reagente 10x QF adicionado a 9mL de tampão de carga Fluo-8, misturado completamente. O Fluo-8 AM é 400X, adicionando 1X o tampão de carga Fluo-8 da formulação acima (com 1x QF), que é o reagente de carga das células Fluo-8.
Algumas células, como as células CHO, necessitam de adição de propilsulfo (Probenecid, CAS: 57-66-9) ao reagente de carga celular Fluo-8 para inibir o transporte celular de Fluo-8 para dentro da célula. A concentração final de propylfeno é recomendada para adicionar o reagente de carga de células Fluo-8, fornecido pelo próprio cliente, de 2,5 mm. Para células diferentes, a concentração ideal pode precisar de otimização.
Preparação de sulfonio:Formulado em 500 mM de NaOH 1N, adicionado ao reagente de carga celular Fluo-8 após diluição anterior a 250 mM com tampão 1X HBSS, a concentração final é de 2,5 M. (O tampão HBSS é fornecido pelo próprio cliente, formulado como tampão HEPES 20 mM pH7.4 + 1X Solução salina equilibrada de Hank, pH 7.4).
7, método padrão de detecção: adição e o volume de reagente de carga celular Fluo-8 no meio dentro do poço da placa de cultura celular, por exemplo, placa de 96 poços com 100 μL de meio por poço para adicionar 100 μL de reagente de carga celular Fluo-8.
（Métodos de teste opcionais:Os meios que contêm 10% FBS podem reduzir a leitura e aumentar o fundo, o meio intraporoso pode ser removido, misturado 1: 1 com o reagente de carga de células Fluo-8 (preparação passos 5 e 6) e tampão HBSS, adicionando o equivalente a 2 vezes o volume do meio original para a detecção desta mistura. Ou usar um meio de baixa concentração de FBS para a cultura celular, conforme o método padrão do passo 7.)
Incubar a 37°C durante 1 hora. Temperaturas específicas de incubação (por exemplo, temperatura ambiente ou 37 ° C) e tempo (0,5 h-2 h ou mais) devem ser otimizados de acordo com o experimento específico.
Detecção de fluxo de cálcio intracelular: ajuste de parâmetros de teste de acordo com as necessidades experimentais e o equipamento de teste, adição de compostos de teste, leituras de fundo para detectar a intensidade da fluorescência. Os equipamentos de teste aplicáveis incluem FlexStation, FLIPR (Dispositivos Moleculares), etc. O FlexStation 3 lê a fluorescência com Ex/Em = 485/525 nm.

A mistura de diferentes lotes não é recomendada.
Não verificado, não é recomendado alterar a dose do reagente de teste.