Microscópio co-focal a laser Leica

O microscópio de confocação a laser Leica TCS SP8 DLS combina as vantagens dos dois sistemas de imagem em um só: com o Leica TCS SP8 DLS (Digital Optics), você pode confocar no microscópio com uma iluminação suave de plano único. Ao desenvolver o espelho TwinFlect, conseguimos transformar a plataforma de confocalização Leica TCS SP8 em um microscópio óptico multifuncional fácil de usar.

Os microscópios confocais a laser Leica (como o Leica SP8 e a série Stellaris) são sistemas de imagem 3D de alta resolução amplamente utilizados em áreas como a biomedicina e a ciência dos materiais. Sua operação requer uma combinação de técnicas ópticas, de controle a laser e de processamento de imagem, e abaixo estão as instruções operacionais detalhadas:

Preparação antes da operação

1. Inspeção ambiental e de equipamentos

Requisitos ambientais:

Câmara escura independente ou ambiente escuro para evitar que a luz externa interfera com o sinal fluorescente.

Controle de temperatura de 20-25 ° C, umidade ≤ 60%, para evitar a exposição da lente ou falhas de circuito.

Inspeção do equipamento:

Verifique se o indicador de estado do laser (por exemplo, 405nm, 488nm, 561nm, 633nm) está normal (o verde está pronto).

Verifique se os objetos (por exemplo, espelhos de óleo 10x/0,3, 20x/0,75, 63x/1,4) estão limpos e se a mesa de carregamento está se movendo suavemente.

Ligue o sistema de resfriamento (por exemplo, refrigerador de água a laser) para garantir que a temperatura esteja estável nos valores definidos (geralmente 18-22 ° C).

2. Preparação da amostra

amostras biológicas:

As células vivas devem ser cultivadas em pratos de Petri dedicados ao cofocalização, como o Lab-Tek II, evitando dificuldades de foco causadas pelo uso de slides comuns.

A corte de tecido fixo requer uma folha de vedação antifluorescente (como ProLong Gold) com espessura ≤ 20 μm.

Amostras de materiais:

As amostras não transparentes devem ser polidas até a rugosidade da superfície Ra < 0,1 μm e as amostras transparentes (como polímeros) devem evitar interferências de fluorescência espontânea.

Requisitos de marcação:

Os corantes fluorescentes devem ser combinados com o comprimento de onda do laser (por exemplo, o DAPI é excitado com 405nm e o Alexa Fluor 488 é excitado com 488nm).

Ao marcar com múltiplas cores, certifique-se de que o espectro de emissão do corante não se sobrepõe (o sinal pode ser separado pela função de separação espectral).

Processo operacional básico

1. Inicialização e inicialização

Ordem de inicialização:

Habilite a fonte de energia total → 2. Iniciar o sistema de resfriamento a laser → 3. Abra o microscópio anfitrião → 4. Inicie o software de controle (como LAS X ou Stellaris Suite).

Autoverificação do software:

O software detecta automaticamente módulos como lasers, cabeças de varredura, bancos de carregamento e outros, confirmando que o estado é "Ready".

Execute a função "Daily Check" para calibrar o caminho óptico e detectar a sensibilidade do sistema (por exemplo, ganho de PMT, potência do laser).

2. Posicionamento e foco da amostra

Visualização de espelho baixo:

Selecione o espelho de ar 10x, desligue o laser e use a luz transmitida, como uma lâmpada de halogênio, para localizar rapidamente a área da amostra.

Mova-se para a posição de destino através do botão XY do suporte ou da navegação do software.

Foco em conjunto:

Ligue o laser 488nm (baixa potência, como 5%) e selecione o modo "Live" para observação em tempo real.

Ajuste o motor passo do eixo Z e use a ferramenta "Foco Fino" para focar gradualmente até que o sinal fluorescente seja forte.

Ao mudar para uma lente duplicada (por exemplo, espelho de óleo 63x), é necessário adicionar um óleo de imersão especial (por exemplo, óleo tipo F) entre a lente e a tampa.

3. Configurações de parâmetros de captura de imagem

Ganho de potência do laser com PMT:

Potência do laser: aumentar gradualmente a partir de 1% para evitar o branqueamento da luz (geralmente não mais de 20%).

Ganho PMT: Ajuste a intensidade do sinal entre 100-800 (imagem de 12 bits) para evitar a saturação (> 4095).

Parâmetros de varredura:

Resolução: escolha 512 x 512 (visualização rápida) ou 2048 x 2048 (imagem de alta precisão), conforme necessário.

Velocidade de digitalização: média de linhas 1-4 vezes (aumenta quando o ruído é alto) e média de quadros 1-8 vezes (diminui quando a imagem de células vivas é dinâmica).

Tamanho da agulha: geralmente definido em 1 unidade Airy (AU), equilibrando a resolução e a relação sinal-ruído.

Configurações do espectro:

Ao marcar com múltiplas cores, digitalize o espectro de emissão da amostra no modo "Lambda Scan" e defina a faixa de comprimentos de onda (por exemplo, DAPI: 410-480nm, Alexa Fluor 488: 500-550nm).

Imagem 3D e sequências temporais

Empilhamento do eixo Z:

Defina a posição inicial / final e o passo (por exemplo, 0,5 μm), o software captura automaticamente imagens de várias camadas e sintetiza modelos 3D.

Série temporal:

Ao fazer imagens de células vivas, defina intervalos de tempo (por exemplo, 1 quadro a cada 30 segundos) e o número total de quadros (por exemplo, 100 quadros) para registrar o processo dinâmico.

Habilite a função "Autofocus" para manter o foco estável e evitar que o movimento das células cause desvio.

Aplicações do microscópio co-focal a laser Leica

Modo de Iluminação (Light Sheet)

Apropriado para imagens rápidas de baixa fototoxicidade em amostras grossas, como embriões de peixe zebra.

Passos operacionais:

Mude para o módulo de luz para ajustar a espessura da luz de iluminação (geralmente 2-5 μm).

Configure a captura sincronizada de duas câmeras (por exemplo, transmissão de luz e sinais fluorescentes).

Reconstrua estruturas tridimensionais juntando imagens multiangulares com a função "Multi-View".

Imagem de hiperresolução (por exemplo, STED)

Quebra o limite de difração com resolução de 20-50nm.

Pontos de operação:

Use objetivos STED dedicados (como lentes de óleo 100x/1,4) e laser de esgotamento (como 592nm).

Ajuste a potência do laser de esgotamento (normalmente 50-200mW) e o modo de máscara de fase (como 2D ou 3D STED).

Após a coleta, use o software "Huygens" ou "Thunder" para processamento anticonvulsivo.

3. Divisão espectral e deconvolução linear

Separar sinais sobrepostos ao marcar com múltiplas cores:

Obtenha a biblioteca de espectro de emissão de amostras no modo "Lambda Scan".

Os dados espectrais são carregados na ferramenta "Spectral Unmixing" e o software calcula automaticamente o sinal puro de cada canal.

Ajuste o limiar para remover o ruído de fundo e salvar a imagem dividida.

IV. Manutenção e manutenção

1. Limpeza diária

Componentes ópticos:

Limpe a poeira da superfície dos objetos e filtros com um balão de sopro e limpe diretamente os bastões de algodão ou toalhas de papel.

Para limpeza, mergulhe uma pequena quantidade de etanol (ou líquido de limpeza especial) com papel de lente e esfregue em espiral.

Carga e armazém de amostras:

Limpe com um pano anti-estático para evitar resíduos de óleo ou vedantes.

2. Manutenção do laser

Limitações de uso:

Trabalhe continuamente por não mais de 8 horas para evitar danos ao sobreaquecimento do tubo laser.

Reduza a potência do laser para 1% antes de desligar o interruptor do laser.

Monitoramento da Vida:

Verifique a vida útil restante na interface "Laser Status" do software (por exemplo, um laser de 488nm normalmente é ≥ 20.000 horas).

Quando chegar ao fim da vida útil, contacte a Leica com antecedência para substituir o tubo laser.

Calibração Periódica

Calibração óptica:

O alinhamento do eixo óptico e da agulha é calibrado trimestralmente com microesferas fluorescentes padrão, como o TetraSpeck.

Calibração mecânica:

Verifique anualmente a precisão do eixo XY / Z da mesa de carregamento (o erro deve ser < 0,1 μm) e ajuste os parâmetros do motor de passo, se necessário.

V. Resolução de problemas frequentes

Imagem sem sinal

Verifique se o laser está ligado, se o ganho PMT é > 0 e se o filtro corresponde (por exemplo, o filtro de emissão não bloqueia o sinal).

Imagem desfocada

Verifique se a imersão em óleo do objetivo é suficiente, se o orifício da agulha está deslocado e se a amostra é plana (por exemplo, a protuberância de células vivas resulta em desfoco).

Potência laser instável

Limpe a janela de saída do laser para verificar se a temperatura da água do sistema de resfriamento está na faixa definida (por exemplo, ± 0,5 ° C).

Cartões de software

Desligue outros programas grandes, diminua a resolução da imagem ou a velocidade de digitalização, ou aumente a memória do computador (recomendado ≥ 32 GB).

Precauções de Segurança para Microscópios de Cofoco Laser Leica

Segurança do laser:

Use óculos de proteção a laser durante a operação (o comprimento de onda deve cobrir todos os fios laser usados).

É proibido olhar diretamente para o feixe de laser ou a luz refletida, evitando a exposição prolongada da pele a lasers de alta potência (por exemplo, > 50mW).

Biosegurança:

Ao lidar com células vivas ou patógenos, opere dentro de um armário de biossegurança para evitar a contaminação da amostra.

Segurança Química:

Quando limpar com solventes orgânicos, como etanol, opere dentro de um armário de ventilação para evitar a inalação de gases voláteis.