Kit de teste de atividade de acetato deshidrogenase (PDH)

Acetonato Deshidrogenase (PDHInstruções do kit de teste de atividade Método Micrométrico

NOTA: O reagente deste produto foi alterado, por favor note e siga estritamente as instruções.

Número da mercadoria:BC0385

Especificações:100T/96S

Composição do produto: verifique cuidadosamente se o volume do reagente é consistente com o volume dentro da garrafa antes de usar, por favor, entre em contato com a equipe da Solebar em tempo útil.

Kit de teste de atividade de acetato deshidrogenase (PDH)

Kit de teste de atividade de acetato deshidrogenase (PDH)

Formulação da solução:

1. Reagentes 2.：Para reagentes voláteis, selar o mais rápido possível após o uso,-20℃Salvar.

2. Preparação do líquido de trabalho: antes da utilização5,75 mlReagentes 4, 1 Reagentes 5,0,45 mlReagentes 6,1,75 mlO reagente sete é transferido para uma garrafa de reagente três misturado para ser dissolvido(Total)15.45em mLAproximadamente.85T）Reagentes sem fim-20℃Partilhado, pode ser guardado4Semana.Evite o congelamento repetido.

Descrição do produto:

PDH（EC 4.1.1.1Amplamente encontrado em animais, plantas, micróbios e células de cultura, é um complexo de acetato desidratase(PDHC)Enzima de limitação de velocidade que cataliza o descarboxílio do óxido de ácido acetónico, cataliza o desoto do ácido acetónicoConecte a glicólise e o ciclo de tricarboxílico.

PDHDeshidrogenação catalítica do ácido acetónico, enquanto reduz2,6-Diclorofenol Indigo2,6-DCPIP), resultando em605 nmRedução da absorção de luz.

ácido pirúvico + tiamina pirofosfato hidroxietil tiamina pirofosfato

Diclorofenolindofenol (605nm) + pirofosfato de hidroxietil tiamina Diclorofenolindofenol reduzido

Observação: escolha antes do experimento é recomendada2-3Uma amostra com grandes diferenças esperadas é pré-experimentada. Se o valor de absorção da amostra não estiver dentro da faixa de medição, recomenda-se diluir ou aumentar o volume da amostra.

Instrumentos e equipamentos necessários:

Espectrofotômetro visível/Calibrador enzimático, panela de banho, centrífuga de mesa, pipeta ajustável, vaso de comparação de vidro/96Placa furada, talha/Absorbente, gelo e água destilada.

Passos operacionais:

Um,Tratamento de amostras(O volume de amostra pode ser ajustado adequadamente, as proporções específicas podem ser consultadas na literatura)

1. Organização: Aproximadamente0.1gOrganização, Junte-se1mlReagentes 1 e10μLReagentes 2, moendo completamente com um amortiguador de banho de gelo ou amortiguador de molho,4 ℃ 11000gCentrífuga10 minutosLimpe-o,Fique no gelo.Teste.

2. amostras de células ou bactérias: coletar primeiro500Milhões de células ou bactérias dentro do tubo de centrifugação, depois de centrifugação descartado; Junte-se depois1em mLReagentes 1 e10μLReagentes 2., banho de gelo ultra-sônico quebra bactérias (potência200 WUltra-som.3 segundosO intervalo.7 segundosTempo total5 minutos）； então11000g，4℃, centrifugação10 minutos，

Remover e colocar no gelo para teste.

3. Soro (pasta)e outras amostras líquidas.Detecção direta.Se a solução estiver turbulenta, centrifuge para a medição.

II. Etapas de medição

1、VisívelEspectrofotômetro ou calibrador enzimático pré-aquecimento30 minutosacima, ajustar o comprimento de onda para605 nmO espectrofotômetro destila água para zero.

2、Cada amostra precisa180μLlíquido de trabalho,De acordo com o experimento necessárioColoque uma certa quantidade de líquido de trabalho em37℃(mamíferos) ou25℃(Outras espécies)Na panela de banhoBanho de água10 minutos。

3、Tubo vazio: em pratos de porcelain ou96Adicionar ao furo180μLlíquido de trabalho e10μLÁgua, misturar, gravar imediatamente605 nmlocal10slocalValor de absorçãoA1e1min10sValor de absorção posteriorA2Calculação.ΔAEspaço= A1-A2。Tubo vazio somente para medição1-2Seguinte。

4、Tubo de medição: em uma placa de porcelain ou96Adicionar ao furo180μLlíquido de trabalho e10μLAmostra, mistura, registro imediato605 nmlocal10slocalValor de absorçãoA3e1min10sValor de absorção posteriorA4Calculação.ΔADeterminação= A3-A4。

Três.PDHCálculo de Atividade

a.A fórmula de cálculo para medição com uma placa de microcomparação é a seguinte:

1. Calculado pela concentração de proteína da amostra

Definição de unidade: cadaem mgA histoproteína é consumida por minuto no sistema de reação1nmol 2,6-O diclorfenol indigo é definido como uma unidade de atividade enzimática.

PDHAtividade (U/mg prot）=[(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço)÷（é×d）× Vcontra-geral×10⁹]÷(Cpr×V)Tipo÷T

= 904,762×(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço÷Cpr

2. Calculado pela qualidade da amostra

Definição de unidade: cadagO tecido é consumido por minuto no sistema de reação1nmol 2,6-O diclorfenol indigo é definido como uma unidade de atividade enzimática.

PDHAtividade (U / gQualidade)=[(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço)÷（é×d）× Vcontra-geral×10⁹]÷(V)Tipo÷VGeral× W) ÷T

= 913,81×(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço÷W

3. Calculação por número de bactérias ou células

Definição de unidade: cada1Milhares de bactérias ou células são consumidas por minuto no sistema de reação.1nmol 2,6-O diclorfenol indigo é definido como uma unidade de atividade enzimática.

PDHAtividade (U/10⁴célula）=[(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço) × Vcontra-geral÷（é×d）×10⁹]÷(V)Tipo÷VGeral× 500) ÷ T

= 1,828×(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço)

4. Calcular pelo volume da amostra

Definição de unidade: cadaem mLlíquidoNo sistema de reaçãoConsumir por minuto1nmol 2,6-O diclorfenol indigo é definido como uma unidade de atividade enzimática.

PDHAtividade（U / mL）=[(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço) × Vcontra-geral÷ (ε × d) × 10⁹]÷VTipo÷T

= 904,762×(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço)

VTotal: volume total do sistema de reação,1.9×10^-4L；ε：2,6-coeficiente molar de dissipação de diclorobefenol,2.1×10⁴L / mol / cm；d: Diâmetro da placa,1cm；Vamostra: adicionar o volume da amostra,0,01 ml；VTotal da amostra: adicionar o volume do reagente I e do reagente II,1,01 ml；TTempo de Reação,1 minuto；CPRconcentração de proteína da amostra,mg / mL；WQualidade da amostra,g；500o número total de bactérias ou células,500Milhares.

b.Usar96A fórmula de cálculo para a medição da placa é a seguinte:

1．Calculado pela concentração de proteína da amostra

Definição de unidade: cadaem mgA histoproteína é consumida por minuto no sistema de reação1nmol 2,6-O diclorfenol indigo é definido como uma unidade de atividade enzimática.

PDHAtividade (U/mg prot）=[(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço) × Vcontra-geral÷（é×d）×10⁹]÷(Cpr×V)Tipo÷T

= 1809,524×(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço÷Cpr

2．Calculado pela qualidade da amostra

Definição de unidade: cadagO tecido é consumido por minuto no sistema de reação1nmol 2,6-O diclorfenol indigo é definido como uma unidade de atividade enzimática.

PDHAtividade (U / gQualidade)=[(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço) × Vcontra-geral÷（é×d）×10⁹]÷(V)Tipo÷VGeral× W) ÷T

= 1827,62×(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço÷W

3．Calculação por número de bactérias ou células

Definição de unidade: cada1Milhares de bactérias ou células são consumidas por minuto no sistema de reação.1nmol 2,6-O diclorfenol indigo é definido como uma unidade de atividade enzimática.

PDHAtividade (U/10⁴célula）=[(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço) × Vcontra-geral÷（é×d）×10⁹]÷(V)Tipo÷VGeral× 500) ÷T

= 3,655×(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço)

4．Calcular pelo volume da amostra

Definição de unidade: cadaem mLlíquidoNo sistema de reaçãoConsumir por minuto1nmol 2,6-O diclorfenol indigo é definido como uma unidade de atividade enzimática.

PDHAtividade（U / mL）=[(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço) × Vcontra-geral÷ (ε × d) × 10⁹]÷VTipo÷T

= 1809,524×(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço)

VTotal: volume total do sistema de reação,1.9×10^-4L；ε：2,6-coeficiente molar de dissipação de diclorobefenol,2.1×10⁴L / mol / cm；d：96Diâmetro do furo,0,5 centímetros；Vamostra: adicionar o volume da amostra,0,01 ml；VTotal da amostra: adicionar o volume do reagente I e do reagente II,1,01 ml；TTempo de Reação,1 minuto；CPRconcentração de proteína da amostra,mg / mL；WQualidade da amostra,g；500o número total de bactérias ou células,500Milhares.

Atenção:

1、Todas as amostras foram colocadas no gelo durante a medição.2Detectar dentro de horas para evitar desgênero e inatividade.

2、Tubo de mediçãoΔAValor em0.01-0.25Entre, se o tubo for determinadoΔAValor maior que0.25É necessário diluir a amostra.Calcule o múltiplo de diluição na fórmula.Se o tubo for medidoΔAValorespequenoem0.01É necessário aumentar o volume da amostra depois de redemensionar, observando a sincronização da modificação da fórmula de cálculo.

3、O reagente contém uma certa concentração de proteína (aproximadamente1mg / mlPortanto, é necessário subtrair a concentração de proteína na amostra.Reagentes 1o conteúdo de proteínas.

Exemplos experimentais:

1、取0.1gFígado de RatoInscrever1mlReagentes 1 e10μLReagentes 2, moendo completamente com um amortiguador de banho de gelo ou amortiguador de molho,4℃、11000gCentrífuga10 minutosRemova o gelo e siga os passos de medição.Traço de quartzo ceramicoMedidocálculoΔADeterminação=A3-A4=1.3106-1.1183=0.1923，ΔAEspaço=A1-A2 =1.3325-1.3314=0.0011Calculando a vida enzimática pela massa da amostra:

PDHAtividade(U/g)Qualidade= 913,81×(ΔA)DeterminaçãoO ΔAEspaço÷W=1747 U/gQualidade.

Publicações relacionadas:

[1]Peng S, Wang Y, Zhou Y, et al. Ginsenosídeos raros melhoram a resistência à insulina miocárdica induzida pela sobrecarga lipídica através da modulação da flexibilidade metabólica [J]. Fitomedicina, 2019, 58: 152745.

Referências:

[1]Guitart M, Andreu A L, García-Arumi E, et al. FATP1 localiza-se nas mitocôndrias e aumenta a atividade da piruvato desidrogenase em miotubos esqueléticos[J]. Mitocondria, 2009, 9(4): 266-272.

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