Kit de ELISA-1aELISA de ratos

Kit de ELISA-1aELISA de ratos

Antecedentes:

O IL-1 tem duas formas moleculares diferentes, uma IL-1α, composta por 159 aminoácidos; Outro, chamado IL-1β, contém 153 aminoácidos; Ambos são codificados por genes diferentes. O gene IL-1 humano e de rato está localizado no cromossomo 2 e contém sete exônios. O precursor de IL-1 (ProIL-1) é de 31 kDa, formando uma molécula madura de IL-1 através da fissão da hidrolase. A IL-1 tem maior homogênia em diferentes gêneros. A nível de aminoácidos, a homogênia de IL-1α e IL-1β é de 60% a 70% e 75% a 78% em diferentes gêneros, respectivamente. No entanto, no mesmo gênero, a homogênia entre IL-1α e IL-1β é de apenas 25%. IL-1α e IL-1β têm pesos moleculares de cerca de 17,5 kDa, pontos isoelétricos de 5 e 7, respectivamente, com 28% de homogênia, e IL-1α e IL-1β se ligam com a mesma afinidade.Superfície celularOs receptores desempenham o mesmo papel biológico.

Princípio de teste：

Solarbio (Solarbio ®)Os kits de ELISA utilizam a tecnologia de detecção de imunosorbenção enzimática ligada baseada na centrifugação bicorpal. Pacotes de anticorpos monoclonais anti-IL-1a do rato foram colocados em placas enzimáticas; Adicionando padrões diluídos em gradiente e amostras pré-diluídas, respectivamente, IL-1a de camundongos no padrão e na amostra se ligam adequadamente aos pacotes na placa de marcação enzimática por anticorpos; Depois de lavar a placa, é adicionado anticorpo biotinado contra IL-1a de rato, que se liga específicamente ao IL-1a de rato no padrão e nas amostras capturadas pelos anticorpos embalados na placa; Depois de lavar a placa, adicionar a peroxidase de raiz (HRP) marcado com a homofilina de cadeia, a biotina e a homofilina de cadeia terão uma ligação não covalente de alta intensidade; Depois de lavar a placa, adicione o substrato colorido TMB, se houver concentrações diferentes de IL-1a de rato na amostra no orifício de reação, a HRP transformará o TMB incolor em uma substância azul de diferentes clareza profunda (correlacionada positivamente), e o orifício de reação se tornará amarelo após a adição do líquido terminante; com λmax = 450 A absorção da amostra do orifício de reação (OD) foi medida em nm (OD = 450 nm), onde a concentração de IL-1a de ratos na amostra foi proporcional à OD, e a concentração de IL-1a de ratos na amostra foi calculada através do desenho de curvas padrão e do software de ajuste de quatro parâmetros.

Princípio:

Atenção:※※※

• O kit deve ser usado durante o prazo de validade, por favor, não use reagentes expirados.
• O kit deve ser mantido no frigorífico de 2-8 ° C quando não é usado, e os produtos padrão que são resólvidos mas não usados ​​devem ser descartados.
• Restaure a temperatura ambiente antes de usar o kit 30 min， Misture completamente os vários ingredientes do kit e as amostras preparadas.
• Os padrões e as amostras são recomendados para testes de poros compostos durante o ensaio e a ordem em que os reagentes são adicionados deve ser mantida*.
• Para evitar a poluição cruzada, use um tubo de ensaio de uso único, uma cabeça de arma, uma membrana de vedação (※e recipientes de plástico limpos. .
• Os anticorpos biotinados concentrados e os compostos enzimáticos concentrados são menores em volume e as pequenas quantidades de líquido podem entrar nas paredes dos tubos e garrafas durante o transporte

Tampa, centrifuge (5-10 S) antes de usar, para que o líquido na parede do tubo se concentre no fundo do tubo e, ao retirar, use o pipete para soprar com cuidado várias vezes.

• Exceto que o líquido de lavagem concentrado e o líquido de terminação no kit possam ser genéricos, não use ensaios contidos no kit de outras fontes

Substituir um único componente nesta caixa.

• Para garantir a precisão dos resultados, é necessário fazer uma curva padrão em cada teste.

Dicas de segurança:O líquido terminante na caixa é uma solução ácida, o operador deve levar luvas e prestar atenção à proteção durante o uso; Evite o contato do reagente com a pele e os olhos durante a operação, se for contactado sem cuidado, lave com muita água limpa; Ao testar amostras de sangue e outras amostras de líquidos corporais, por favor, aplique as regras de gestão relacionadas à proteção da segurança do Laboratório Biológico Nacional.

Composição e armazenamento do kit：

Equipamento experimental próprio (não disponível, disponível sob encomenda)

• Calibrador enzimático (comprimento de onda principal 450 nm, comprimento de onda de referência 630 nm)
• Pipetes de alta precisão e sucção única: 0,5-10,2-20,20-200,200-1000 μl
• Máquina de lavar louça ou garrafa
• 37℃Caixa de incubação
• Água dupla a vapor, água deionizada, cilindro, etc.
• Tubos de ensaio de polipropileno para diluição

Coleta e armazenamento de amostras:

• Cultura de células:

Mover o meio de cultura celular para um tubo de centrifugação estéril, centrifugar 1000 x g em 4 ° C por 10 min, em seguida, dividir a quantidade equivalente de soro superior em tubos EP pequenos e conservar a -20 ° C (a detecção pode ser colocada em armazenamento de 2-8 ° C dentro de 24 horas), para evitar o congelamento repetido.

• Amostras de soro:

Depois de 20 minutos de coagulação natural do sangue a temperatura ambiente, centrifuge 1000 x g em condições de 4 ° C por 10 minutos, em seguida, divide a quantidade equivalente de líquido superior em pequenos tubos EP e guarde a -20 ° C (a detecção pode ser colocada em armazenamento de 2-8 ° C dentro de 24 horas), se houver precipitação durante a conservação, centrifuge novamente para evitar o congelamento repetido.

• Amostras de plasma:

Coletar sangue inteiro em um tubo contendo anticoagulante, escolher EDTA, citrato de sódio ou hepatina como anticoagulante de acordo com os requisitos reais da amostra, misturar 20 min, centrifugar 1000 x g em condições de 4 ° C por 10 min, em seguida, dividir a quantidade equivalente de soro superior em um tubo EP pequeno e conservar a -20 ° C (a detecção dentro de 24 horas pode ser colocada em armazenamento de 2-8 ° C), para evitar a congelação repetida.

※Atenção:As amostras de plasma sérico evitam o uso de amostras hemolíticas e hiperlipídicas para não afetar os resultados do teste; Se a concentração de detecção do alvo na amostra for maior do que o valor padrão, teste a amostra após diluição de múltiplos apropriados e recomenda-se um pré-experimento antes do experimento formal para determinar o múltiplo de diluição.

Preparação do Reagente：

• Reagentes de retorno à temperatura: primeiro, 30 min antes do experimento, a caixa de reagentes, a amostra a ser testada é colocada a temperatura ambiente, o líquido de lavagem concentrado se o cristal aparecer, por favor, coloque no banho quente de 37 ° C até que o cristal se dissolva completamente.
• Preparação do líquido de lavagem: pré-calcular o volume de uso do líquido de lavagem diluído, em seguida, diluir o líquido de lavagem concentrado 20 vezes com vapor duplo ou água deionizada para aplicar o líquido 2 vezes, o líquido de lavagem concentrado não usado é colocado no frigorífico de 4 ° C para conservar.

Dilução em gradiente do produto padrão: adicione o produto padrão / diluído de amostra (SR1) em 1 ml do produto padrão para liofilização, deixe-o em reposição por 15 minutos até que ele * se dissolva e misture suavemente (concentração de 2000 pg / ml), em seguida, dilua de acordo com as seguintes concentrações: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 0 pg / ml. O líquido padrão original (2000 pg / ml) não usado deve ser descartado ou, conforme necessário, dividido em uma única dose e armazenado em um frigorífico de -20 a -80 ° C, conforme indicado na figura abaixo.

Liquido de trabalho de anticorpos biotinizados: pré-calcular a quantidade necessária para o teste, diluir o concentrado de anticorpos 100 vezes com o diluído de detecção (SR2) para aplicar o líquido de trabalho 2 vezes (misturar completamente antes da diluição), adicione ao buraco de reação dentro de 30 minutos.

Liquido de trabalho específico de anticorpos biotinizadosMétodo de diluiçãoAssim como segue:

Liquido de trabalho do composto enzimático: preparado de acordo com a dose necessária para cada ensaio, dilua o composto enzimático concentrado 100 vezes para diluir o composto enzimático em 1 vez o líquido de trabalho aplicado (centrifugação pré-diluição), use dentro de 30 minutos.

Liquido de trabalho específico de compostos enzimáticosMétodo de diluiçãoAssim como segue:

6. Método de lavagem:

• Lavagem automática da placa: descarte o líquido no buraco da placa de marcação enzimática, seca no papel de absorção de água espessa, injeta o líquido de lavagem de 300 ul / buraco, injeta e extrai o intervalo de 30 segundos, lave a placa 5 vezes.
• Lavar a placa manualmente: derramar o líquido no buraco da placa de marcação enzimática, secar no papel de absorção de água de uma camada grossa, adicionar 300 ul / buraco de líquido de lavagem com uma garrafa de lavagem, depois de 30 segundos para limpar o líquido no buraco da placa de marcação enzimática, secar no papel de absorção de água de uma camada grossa, lavar a placa 5 vezes.

Passos de detecção:

Resultado do julgamento：

Determine o OD com um calibrador enzimático de 450 nm de comprimento de onda. Selecione a detecção de comprimento de onda duplo com o comprimento de onda de referência de 630 nm. Se a detecção de comprimento de onda duplo não for possível, subtraia o OD de 630 nm com o OD de 450 nm.

Calcular o valor médio de OD de cada produto padrão e amostra: o valor de OD de cada produto padrão e amostra deve ser subtraido do valor de OD de zero.

3. com a concentração do produto padrão como coordenadas transversais, o valor do OD da absorção como coordenadas longitudinais, com o software para desenhar a curva padrão, o conteúdo de IL-1a na amostra pode ser convertido pela concentração correspondente da curva padrão através do valor do OD correspondente.

Se o valor de OD da amostra for superior ao limite superior da curva padrão, deve ser reexaminado após diluição adequada e multiplicado pelo múltiplo de diluição ao calcular a concentração.

Caracterização de parâmetros：

Dados e curvas padrão

Este gráfico é somente de referência e o teor de amostra de IL-1A em ratos deve ser calculado usando a curva padrão desenhada nos padrões do ensaio atual.

2. Sensibilidade:

Concentrações baixas de IL-1a detectadas em ratos de até 15 pg/ml,

A média de 20 OD de concentração padrão zero, juntamente com dois desvios padrão, calcula a concentração detectável correspondente.

3. Especificação:

Não reagiu com IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12, 13 em ratos, IL-1 em ratosβEspere a reação.

4. Repetibilidade:

Coeficiente de variação entre placas < 10%

5. Taxa de recuperação:

A taxa de recuperação foi calculada adicionando 3 níveis diferentes de concentração de IL-1a de ratos no plasma de ratos saudáveis ​​selecionados.

6. Dilução linear：

Altas concentrações de IL-1a de ratos foram adicionadas ao soro superior de plasma e cultura celular de ratos saudáveis ​​selecionados em 4 porções, respectivamente, diluído dentro da faixa dinâmica da curva padrão para avaliar a linearidade.

Referências：

1. Greenfeder, S.A. et al. (1995) J. Biol. Química.270:13575.

2. Wesche, H. et al. (1997) J. Biol. Química.272:7727.

3. Sims, J.E. et al. (1994) Clínica. Imunos. Imunopatol.72:9.

4. Sims, J.E. et al. (1993) Proc. Natl. Acadêmico. Ciência. EUA90:6155.

5. Colotta, F. e A. Mantovani (1994) Tendências Pharmacol. Ciência.14:138.

6. Svenson, M. et al. (1993) Citocina5:427.

7. Giri, J.G. et al. (1994) J. Imunol.153:5802.

Perguntas frequentes e soluções：

Kit de ELISA-1aELISA de ratosInstruções de encomenda:

A grande maioria dos produtos estão em stock, em geral, podem ser encomendados no mesmo dia de envio.
Alguns produtos muito usados ​​precisam ser reservados com 1-2 dias de antecedência e futuros no exterior precisam ser reservados com 3-6 semanas de antecedência.
Os preços de alguns produtos podem mudar devido ao período de entrega, lote e outros fatores, se houver mudança, o novo preço no dia do pedido será aplicado.
O prazo para pedidos diários é das 16h, algumas cidades podem chegar às 17h, devido ao excedimento do prazo, os que não podem enviar no dia seguinte serão enviados no dia seguinte.
5, por favor, depois de concluir o pagamento, comunique-nos com o endereço do destinatário, nome, etc. por fax, mensagem de texto, etc.

Instruções de transporte:

Produtos de extrema baixa temperatura: o transporte de gelo seco durante o transporte de produtos de extrema baixa temperatura. Envolva o produto com gelo seco, sela a caixa de espuma, pegue a caixa de espuma em camadas de fita, coloque-a na caixa da Solebar e entregue-a à cooperação expressa, segura, rápida e eficiente e segura nas mãos dos clientes, garantindo a estabilidade do produto e acompanhando seu experimento.
Produtos a baixa temperatura: Sacos de gelo da Soleibol são adicionados durante o transporte de produtos a baixa temperatura. Envolver o produto com um saco de gelo, selar a caixa de espuma, selar a caixa de espuma com fita, colocar a caixa da Solebar (o efeito de isolamento pode durar menos de uma semana), em seguida, entregar para a cooperação expressa, segura, rápida e eficiente e segura para as mãos dos clientes, garantir a estabilidade da natureza do produto e acompanhar o seu experimento.
Produtos a temperatura normal: o transporte de produtos a temperatura normal não requer gelo ou embalagens especiais. Os produtos são distribuídos rapidamente pelo pessoal de armazém da empresa, e a entrega rápida e eficiente garante a entrega rápida dos produtos em suas mãos.