One Step Gibson Cloning Kit (Kit de Clonagem Gibson)

Kit de clonagem Gibson de um passo

(Conexão de 1 a 5 peças)

One Step Gibson Cloning Kit (Kit de Clonagem Gibson)

Número de catálogo:42112

Quantidade de embalagem:

Armazenamento de produtos:-20°CConservar para evitar o congelamento repetido

Descrição do produto: Este produto não depende deT4Enzimas de ligação, não limitadas pelo ponto de corte enzimático do veículo e do fragmento de destino, mas diretamente com o método de recombinação de fragmentos sobrepostos, com uma combinação enzimática especial que pode linearizar o veículo após qualquer método e com suas duas extremidades15-25bpÁreas sobrepostasPCRReorganização direcional de segmento (extremo plano) que pode ser realizada rapidamente1-5Clonagem eficiente e perfeita de um fragmento.

Características do produto:

1. 30Um minuto pode ser curto ou longo.PCRInserir um segmento de expansão (extremo plano) no veículo.

2. Disponibilidade e ponta plana do veículo independente do veículo e da inserção de fragmentação enzimática/A limitação da extremidade viscosa pode ser clonada em qualquer local.

3.Para uma clonação perfeita, os pontos de inserção não introduzem sequências de bases indesejadas.

4.Eficiência, precisão e taxa positiva95%。

Preparação de portadores lineares e inserção de fragmentos de DNA:

A: Preparação de veículos lineares

(1). Fontes enzimáticas:O veículo linear obtido pela corte enzimático, a extremidade plana ou a cola, a corte monoenzimático ou a corte bienzimático podem ser recuperados após a corte enzimático.

NOTA: Não há conectase de DNA de dupla cadeia no sistema de ligação e clonagem sem costura e não ocorre uma reação de auto-ligação do veículo. Assim, mesmo os veículos lineares preparados por corte monoenzimático não necessitam de desfosforização final. Os clones falsamente positivos (sem fragmentos de inserção) que surgem após a transformação do produto recombinante são formados por uma transformação enzimática de um veículo anel totalmente não linearizado. Recomendamos que a reciclagem de cola pós-corte enzimático reduza essa proporção de veículos não lineares para baixos graus zui.

(2). Fontes de PCR Reversa:Recomenda-se a utilização de DNA polimerase de alta fidelidade (n.º: P517-05), se a banda amplificada pode ser obtida como um único veículo através da purificação do produto de PCR (n.º: DC012-100) ou, caso contrário, através da recuperação de cola (n.º: DC011-100).

NOTA: O modelo de plasmidro da PCR inversa também é um veículo não linear e também pode levar a clonagem falsamente positiva (sem fragmento de inserção), portanto, a digestão do modelo de plasmidro com endocesase Dpn I antes da purificação do veículo linear da fonte da PCR (produto da PCR) pode reduzir o fundo e aumentar a taxa de positivo. No entanto, em geral, a recuperação de cola é suficiente para reduzir essa proporção de veículos não lineares para zui baixa, portanto, os veículos lineares de origem reversa PCR também recomendamos a recuperação de cola.

B: Preparação para a inserção de fragmentos de DNA

(1). Desenho de primeiros de clonagem de segmento único de inserção: os primeiros de clonagem incluem sequências de primeiros específicos de segmento de inserção e sequências sobrepostas.

Clonagem de primeiros positivos (5’-3’): sequência de sobreposição de 16-25 nt em direção ao veículo linear (a partir do extremo de 3’) + sequência de primeiros específicos em direção ao segmento de inserção (18-25 nt)

Clonagem de primeiros inversos (5’-3’): sequência de sobreposição de 16-25 nt inversa do veículo linear (a partir do extremo de 3’) + sequência de primeiros específicos inversa do segmento de inserção (18-25 nt)

Atenção:O número de bases das áreas sobrepostas deve ser de pelo menos 16 bp e os valores de Tm entre as áreas sobrepostas devem ser consistentes e OO O par AT = 2 ° C e par GC = 4 ° C, caso contrário, o número de bases pode ser prolongado até que os requisitos sejam cumpridos.

De acordo com a estrutura da extremidade do transportador linear (5 'saliente, 3 'saliente, extremo plano), o projeto do introdutor também é dividido em 3 situações.

As duas extremidades do veículo linearizado são diferentes devido ao modo linear (como corte monoenzimático, corte bienzimático, PCR inversa), pode ser uma combinação arbitrária de duas ou duas das três estruturas terminais acima, o princípio de design de precursor específico do segmento de inserção pode seguir o princípio de design de precursor geral.

Ao calcular a temperatura de encendamento do precursor amplificado, basta calcular o valor Tm da sequência amplificada genética específica, e a sequência homogênica do terminal do veículo não deve participar do cálculo.

De acordo com o princípio de design acima, o cálculo começa a partir da extremidade 3', contando de volta de 16bp a 25bp (neste exemplo, os extremos de 20 bp se sobrepõem à mesma sequência) antes da sequência de primeiros específicos do segmento de destino. Certifique-se de que o valor Tm da área de sobreposição é consistente e VeriVeriVerifiqueque o par AT = 2°C e par GC = 4°C.

Os primeiros são os seguintes: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGN N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

Observação: Após a conexão de clonagem concluída com o desenho do precursor acima, o ponto de corte enzimático EcoR I desaparecerá (não mantém o ponto de corte enzimático).

Se necessário reservar Pontos de localização enzimática EcoR I, que exigem complementar a sequência de localização de identificação EcoR I ausente entre a sequência de sobreposição de 20 bp no extremo do veículo e a sequência de precursor específico do segmento de destino aattc,Após a conclusão da conexão clonal, o ponto de corte enzimático EcoR I permanece presente (ponto de corte enzimático retenido).

Especificamente: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

O veículo é cortado pela enzima Hind III para formar uma extremidade saliente de 5':

De acordo com o princípio de design acima, o cálculo começa a partir da extremidade 3', contando de volta de 16bp a 25bp (neste exemplo, os extremos de 20 bp se sobrepõem à mesma sequência) antes da sequência de primeiros específicos do segmento de destino. Certifique-se de que o valor Tm da área de sobreposição é consistente e VeriVeriVerifiqueque o par AT = 2°C e par GC = 4°C.

O desenho inverso é o seguinte: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCAN N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

Observação: Após a conclusão da conexão de clonagem com o desenho do precursor acima, o ponto de corte Hind III desaparecerá (o ponto de corte enzimático não é mantido).

Se necessário reservar Pontos de localização enzimática Hind III que requerem complementar a sequência de localização de identificação Hind III ausente entre a sequência de sobreposição de 20 bp no extremo do veículo e a sequência de precursor específico do segmento de destino agctt ，A localização enzimática Hind III permanece presente (localização enzimática retenida).

Especificamente: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCA Agctt N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

(2). Projeto de precursor clonado para múltiplos segmentos de inserção: método de projeto de precursor de segmento de inserção conectado a ambas as extremidades do veículo e método de projeto de segmento único

* O design de sobreposição entre vários segmentos de inserção tem as duas maneiras acima mencionadas (azul e vermelho), no design de introdução de múltiplos segmentos, você pode escolher qualquer um ou misturar ambos os modos para garantir uma sobreposição de 15-25bp entre o segmento e o segmento.

(3). Escolha da enzima: recomenda-se a utilização de DNA polimerase de alta fidelidade ou de PCR Mix (código: P517-05 ou P814-05).

(4). Condições de reação: geralmente de acordo com as instruções específicas da polimerase usada.

(5). Purificar o segmento de inserção

lOpcional:Se o fragmento é derivado de um modelo de plasmido e o plasmido tem a mesma resistência que o veículo recombinante, digerir o modelo de plasmido antes da purificação com a enzima endocesa Dpn I pode reduzir o fundo e aumentar a taxa de positivo.

lSe o fragmento for único, recomenda-se a purificação do fragmento com um kit de purificação de produto de PCR (n.º 43012-100).

lSe houver amplificação não específica, recomenda-se a recuperação dos fragmentos com um kit de recuperação de cola (n.º 43011-100).

lUsando este método de clonagem, o ponto de corte enzimático usado para linearizar o veículo vai faltar no momento da junção, se houver requisitos estritos para o ponto de corte enzimático, é recomendado Atenção à escolha do local enzimático, se necessárioA sobreposição entre as sequências de regiões de precursores de clonagem positiva e inversa e as sequências de genes específicosAdicione as bases faltantes para restaurar o local enzimático original (veja o exemplo de desenho de precursor inverso positivo acima).

lSe os plasmídeos recombinantes forem usados ​​para a expressão de proteínas, observe a caixa de leitura do código ao projetar o precursor, e as sequências necessárias para a expressão e purificação de proteínas (por exemplo, iniciadores, sequências RBS, códons iniciais, códons terminais, etiquetas de proteínas, etc.) não serão danificadas.

Etapas operacionais para uma reação de clonagem perfeita:

NOTA: 2 × Cloning Master Mix contém reforçador de ligação PEG é muito viscoso, mais viscoso quando tirado do frigorífico a baixa temperatura, pode ser colocado na mão congelado por alguns minutos para aumentar a temperatura para reduzir a viscosidade (sem afetar a qualidade), dedosBo bater o fundo do tubo centrífugo misturado completamente ou turbulento misturado.

1. Estabeleça o sistema de reação de acordo com a tabela abaixo (pode ser preparado a temperatura ambiente usando tubos de PCR)

* O veículo é geralmente usado em 10-50 ng, a melhor proporção de molar entre o segmento inserido e o veículo é entre 2: 1-3: 1; Se o segmento inserido é menor de 200bp, a relação de molécula entre o segmento inserido e o veículo é de 5:1 e, no caso de conexões de múltiplos segmentos, a relação de molécula entre o segmento e o segmento é de 1:1.

2. Misture suavemente, em 50°A reação C dura 15 minutos (pode ser realizada em um instrumento de PCR) e após a reação, a PCR é transformada diretamente ou mantida em -20 após colocação no gelo.°C. Conexão de mais de 3 segmentos, pode prolongar o tempo de reação para 30 minutos.

3. Tome 5 μl do produto da reação para converter de acordo com as instruções das células sensíveis (todos os produtos podem ser convertidos e todo o líquido de conversão revestido se houver menos transformadores).

Identificação de clonagem positiva:

Dependendo das circunstâncias específicas, a identificação por PCR de colônia pode ser selecionada, extraindo plasmídeos (n.º 31011-100) para identificação enzimática restritiva ou identificação de sequência.

One Step Gibson Cloning Kit (Kit de Clonagem Gibson)