Kit de clonagem rápida do veículo simples pBLUE-T Princípio T4

pBLUE-T simplesKit de clonagem rápida do veículo

Kit de clonagem rápida do veículo simples pBLUE-T Princípio T4

Número de catálogo:42119

Composição, armazenamento e estabilidade:

Armazenamento a 20 ° C, não afeta o efeito do uso durante 6 meses.

Introdução do produto:

O pBLUE-T Simple Vector é um veículo dedicado para a clonação eficiente de produtos de PCR (TA Cloning). Este veículo é modificado pelo plasmido pBlueScript II SK(+) e, ao contrário do método tradicional de extração de T após corte do veículo T ECOR V, o pSURE-T Simple transforma o pBlueScript II SK(+) para produzir bases T não emparelhadas diretamente no extremo 3’ de ambos os lados do local de polyclonagem original após a introdução de Xcm I no local de polyclonagem original pBlueScript II SK(+), com maior eficiência de recombinação. Ao mesmo tempo, ele elimina a localização enzimática polyclonal no veículo pBlueScript II SK(+) e requer a importação de localização enzimática adequada no precursor de amplificação de PCR. Neste momento, se o corte enzimático de DNA for realizado usando os locais de corte enzimático importados pelo introdutor de amplificação de PCR, a reação de corte enzimático não será afetada por enzimas restritas em outros locais de corte enzimático polyclonal no veículo T, o que pode melhorar significativamente a eficiência de corte enzimático e aumentar a taxa de sucesso de subclonação. Além disso, o sistema de conexão do veículo da empresa possui características como baixo fundo (menos de 10% das manchas azuis), alta taxa de recombinação (mais de 90% das manchas brancas têm segmentos inseridos) e conexão rápida. As informações técnicas relacionadas com o veículo pBLUE-T Simple são listadas no final deste documento, cuja sequência completa pode ser referenciada à sequência SK(+) pBlueScript II, mas a sequência de localização da polyclonase é ligeiramente diferente.

Sequenciamento recomendado com o primer de sequenciamento universal M13 e o sub-primer iniciador T3 (veja o gráfico posterior)
Passos operacionais:
Preparação da reação de conexão

Se o produto de PCR deve ser purificado depende da qualidade do produto amplificado. Se o produto da PCR for muito limpo, a reação de ligação pode ser realizada diretamente sem purificação. No entanto, se o produto de PCR é baseado em plasmídeos como modelo, ele deve ser purificado e os plasmídeos do modelo também podem formar manchas brancas. Os produtos da PCR podem ser isolados por eletroferese em gel de aglomerase. Os kits de reciclagem de purificação rápida de produtos de DNA produzidos pela empresa são excelentes para a reciclagem de fragmentos de DNA acima de 70 bp.

Produtos de PCR amplificados por DNA polimerase Taq, Tth, AmpliTaq e KlenTaq, todos com um 3’ saliente nas extremidades-A. Tem 3’-Os produtos da PCR no terminal A podem ser clonados diretamente com o veículo pBLUE-T Simple. Tem 3’®O produto de PCR amplificado pela DNA polimerase (polimerase de alta fidelidade) com atividade de 5' de extraceptase é de extremo plano, para clonar este produto de PCR de extremo plano, deve ser feito primeiro 3'--Função A.

2. Reações gerais de conexão:

1) Em um padrão de 10ml Conecte o sistema de reação, adicionando 1mL 30% de pblue-t simplesml Produtos de PCR (em condições normais, não é necessário quantificar exatamente os produtos de PCR, a proporção molar de produtos de PCR e veículos gerais é otimizada para 2: 1 a 10: 1 para obter bons resultados, recomendado 3: 1)ml 10´Buffer de ligação e 0,5-1ml (2,5 -5 unidades de Weiss) de T4 DNA Ligase, o resto é suplementado com água. A reação é realizada de acordo com o seguinte sistema:

A ligase de DNA T4 é adicionada.

2) Conexão a 16 ° C durante a noite (geralmente pode ser feita em um instrumento de PCR).

Geralmente recomendado 16 ° C ligação durante a noite (10mA quantidade padrão de ligação do sistema é de apenas 2,5 unidades Weiss) para obter o maior número de conversores. No entanto, este sistema contém o PEG Enhancer que pode melhorar a eficiência da conexão várias vezes, em casos de altas doses de conectores (10).mO sistema recomenda a dose de ligação de 5 unidades Weiss) 16 ° C ligação por 30 minutos para atingir os requisitos gerais do estudo.

3) Resfriar no gelo e, em seguida, transformar ou armazenar a -20 ° C.

3. Reação rápida de conexão:

1) A reação é realizada de acordo com o seguinte sistema:

A ligase de DNA T4 é adicionada.

2) 22 ° C conectar por 5-10 minutos (geralmente pode ser feito em um instrumento de PCR).

2 ´O Quick Ligation Buffer já contém todos os componentes de ligação rápida otimizados e é geralmente recomendado para uma ligação de 22 ° C por 10 minutos (10 minutos).mL A dose de ligação do sistema é de 5 unidades Weiss, a ligação de segmentos longos pode ser prolongada até 30 minutos) geralmente pode obter resultados satisfatórios. Além disso, o sistema também pode ser conectado a 16 ° C por 30 minutos (10mA dose de ligação do sistema é de 5 unidades Weiss) para atender aos requisitos gerais do estudo.

3) Resfriar no gelo e, em seguida, transformar ou armazenar a -20 ° C.

4. Conversão:

em 50-100ml Células sensíveis, colocadas no gelo e suspensas uniformemente as células várias vezes após o descongelamento total.

em Junte-se 4-5mL O líquido de conexão (pode ser adicionado até totalmente, desde que o volume não exceda 1/10 do volume das células sensíveis), misture suavemente. Deixe no gelo por 30 minutos. 42 ° C banho quente durante 90 segundos. Deixe no gelo por 2 a 3 minutos.

em Mais 500mL LB ou SOC meio (sem antibióticos), 37 ° C 150 rpm oscilação de cultura por 60 minutos.

em Serão 200ml Bactérias revestidas em pré-uso 16m50 mg/ml de IPTG e 40ml 20 mg/ml X-gal revestido em comprimidos de penicilina su.

A dose de bactéria revestida é ajustada adequadamente de acordo com a eficiência da conexão e a sensibilidade das células sensíveis, se menos clonação prevista, parte do líquido de cultura pode ser absorvida por centrifugação (4.000 rpm, 2 minutos), deixando a quantidade adequada de meio de cultura em suspensão de bactéria após a retirada total ou a quantidade moderada pode ser revestida em uma placa (o líquido restante revestido pode ser mantido em 4 graus e conservado no dia 2, se o número de colônias convertidas for menor, o líquido restante pode ser revestido em uma nova placa de cultura).

em O comprimido é colocado em direção a 37 ° C por 1 hora para absorver o excesso de líquido e, em seguida, inverte a cultura durante a noite.

5 Filtração:

1). Filtração azul e branco do conversor:

Quando um fragmento de DNA exótico é inserido no pBLUE-T Simple, a presença de uma sequência de ácidos nucleicos do DNA exótico altera a codificação do gene LacZ, afetando seu produto.b-Semilactosidaseum-A atividade do fragmento e, portanto, o clone recombinante é apresentado em branco na placa X-gal/IPTG, em vez do clone recombinante em azul. Às vezes, a inserção do fragmento não afeta a caixa de leitura do gene lacZ, ou a inserção do fragmento é muito pequena, neste caso a colônia (clone recombinante) apresenta um azul claro ou uma mancha azul claro no centro da colônia, com o círculo exterior branco (olho de peixe azul). Escolha colônias brancas ou azuis claros que cresçam em comprimidos IPTG/X-gal, selecione com uma barra de dentes um meio líquido contendo ampecilina su e cultive durante a noite a 37°C.

2). Identificação do conversor:

a. Extrair plasmídeos com a bactéria da colônia branca cultivada acima, cortar enzimáticamente com o ponto de localização enzimática levado para a inserção do fragmento e verificar o tamanho do fragmento por eletroferese em gel de againe para determinar se contém o fragmento de destino.

b. Escolha colônias brancas para teste PCR direto

c. Sequenciamento com o subiniciador iniciador T3 ou o iniciador de sequência genérica M13 para determinar se houve clonagem de destino.

em Como calcular a quantidade de produtos de PCR necessários para a reação de conexão?

A proporção molar do produto de PCR e do veículo é otimizada para 2:1 a 10:1 (recomendado 3:1) para obter bons resultados, usando a seguinte fórmula:

[A quantidade de inserção do veículo (ng) × tamanho do segmento de inserção (kb) ÷ tamanho do veículo (kb)] × a proporção molar do segmento de inserção e do veículo = a quantidade do segmento de inserção (ng) Por exemplo: a proporção molar do segmento de inserção e da conexão do veículo é de 3: 1, se a reação de conexão adicionar o veículo 40ng, o tamanho do segmento de inserção é de 1000bp, então a quantidade do segmento de inserção deve ser adicionada como [40ng veículo × 1kb inserção do segmento ÷ 2,928kb veículo] × 3/1 = 40,1ng.

Kit de clonagem rápida do veículo simples pBLUE-T Princípio T4