One Step Seamless Cloning Kit (em inglês)

Kit de clonagem sem costura de um passo (Seção única)

One Step Seamless Cloning Kit (em inglês)

Número de catálogo:42111

Quantidade de embalagem:

Armazenamento de produtos:-20°C Conservar para evitar congelamento repetido

Descrição do produto:O kit de clonagem sem problemas do método de um passo não depende da conectase T4 e não é limitado pelo local enzimático do veículo e do fragmento de destino, mas diretamente com o método de recombinação de fragmentos sobrepostos, com uma combinação enzimática especial, o veículo linearizado de qualquer método e a recombinação direcionada do fragmento de PCR com a área de sobreposição de 16-25bp com suas duas extremidades podem ser conectadas, para alcançar uma clonagem sem problemas eficiente e direcionada do fragmento de produto de PCR de extremo A ou extremo plano para qualquer local do veículo em 30 minutos.

Características do produto:

1. Um clone de fragmento de amplificação de PCR de 50bp-15kb (terminal planar/A) pode ser inserido em qualquer lugar de qualquer veículo em 30 minutos.

A clonação pode ser feita em qualquer local, sem restrições à disponibilidade do veículo e do ponto de corte de fragmentação e da extremidade / viscosidade.

3. Para uma clonação perfeita, os pontos de inserção não introduzem sequências de bases indesejadas.

4. Não depende de conectase e fosfatase, eficiente, preciso, taxa de clonagem positiva pode ser superior a 95%.

Esquema do princípio do kit de clonagem perfeita em um passo:

Preparação de portadores lineares e inserção de fragmentos de DNA:

APreparação de veículos lineares

(1). Fonte de corte enzimático: o veículo linear obtido pelo corte enzimático, a extremidade plana ou a pegamento, o corte enzimático único ou o corte bienzimático podem ser recuperados após o corte enzimático.

NOTA: Não há conectase de DNA de dupla cadeia no sistema de reação de clonagem sem problemas de um passo e não ocorre a reação de auto-ligação do veículo. Assim, mesmo os veículos lineares preparados por corte monoenzimático não necessitam de desfosforização final. Os clones falsamente positivos (sem fragmentos de inserção) que surgem após a transformação do produto recombinante são formados por uma transformação enzimática de um veículo anel totalmente não linearizado. Recomendamos que a reciclagem de cola pós-corte enzimático reduza essa proporção de veículos não lineares para baixos graus zui.

(2). Fonte de PCR inversa: recomenda-se a preparação de DNA polimerase de alta fidelidade, se a banda amplificada pode ser obtida por meio de um único veículo através da purificação do produto de PCR (número de produto: DC012-50) ou, caso contrário, através da recuperação de cola (número de produto: DC011-50).

NOTA: O modelo de plasmidro da PCR inversa também é um veículo não linear e também pode levar a clonagem falsamente positiva (sem fragmento de inserção), portanto, a digestão do modelo de plasmidro com endocesase Dpn I antes da purificação do veículo linear da fonte da PCR (produto da PCR) pode reduzir o fundo e aumentar a taxa de positivo. No entanto, em geral, a recuperação de cola é suficiente para reduzir essa proporção de veículos não lineares para zui baixa, portanto, os veículos lineares de origem reversa PCR também recomendamos a recuperação de cola.

BPreparação da inserção de fragmentos de DNA

(1). O princípio geral do projeto de primário de clonagem sem problemas de um passo é que, através da introdução de sequências homogêneas no extremo do veículo de clonagem linear no extremo 5’ do primário, os produtos de amplificação de fragmentos inseridos no extremo 5’ e 3’ têm sequências totalmente coerentes com o wan correspondente aos dois extremos do veículo de clonagem linear (16 bp a 20 bp), respectivamente.

(2). Desenho de primeiros de fragmento inserido: os primeiros clonados incluem sequências de primeiros específicos de fragmento inseridos e sequências sobrepostas.

Clonagem de primeiros positivos (5’-3’): sequência de sobreposição de 16-25 nt em direção ao veículo linear (a partir do extremo de 3’) + sequência de primeiros específicos em direção ao segmento de inserção (18-25 nt)

Clonagem de primeiros inversos (5’-3’): sequência de sobreposição de 16-25 nt inversa do veículo linear (a partir do extremo de 3’) + sequência de primeiros específicos inversa do segmento de inserção (18-25 nt)

Nota: O número de bases das áreas sobrepostas deve ser de pelo menos 16 bp e os valores de Tm entre várias áreas sobrepostas devem ser consistentes e <60°C (par AT = 2°C e par GC = 4°C), caso contrário, o número de bases pode ser prolongado até que os requisitos sejam cumpridos.

De acordo com a estrutura da extremidade do transportador linear (5 'saliente, 3 'saliente, extremo plano), o projeto do introdutor também é dividido em 3 situações, mostrando o seguinte:

As duas extremidades do veículo linearizado são diferentes devido ao modo linear (como corte monoenzimático, corte bienzimático, PCR inversa), pode ser uma combinação arbitrária de duas ou duas das três estruturas terminais acima, o princípio de design de precursor específico do segmento de inserção pode seguir o princípio de design de precursor geral.

Ao calcular a temperatura de encendamento do precursor amplificado, basta calcular o valor Tm da sequência amplificada genética específica, e a sequência homogênica do terminal do veículo não deve participar do cálculo.

(3). Escolha da enzima: recomenda-se a utilização de DNA polimerase de alta fidelidade ou de PCR Mix (código: P517-05 ou P814-05).

(4). Condições de reação: geralmente de acordo com as instruções específicas da polimerase usada.

(5). Purificar o segmento de inserção

l Opcional: se o fragmento é derivado de um modelo de plasmido e o plasmido tem a mesma resistência que o veículo recombinante, digerir o modelo de plasmido com a enzima endocutânea Dpn I antes da purificação pode reduzir o fundo e aumentar a taxa de positivo.

l Se o fragmento for único, recomenda-se a purificação do fragmento com um kit de purificação de produto de PCR (código DC012-100).

l Se houver amplificação não específica, recomenda-se que os fragmentos sejam reciclados com uma caixa de recuperação de cola (número DC011-100).

l Usando este método de clonagem, o ponto de corte enzimático usado para linearizar o veículo vai faltar no momento da junção, se houver requisitos estritos para o ponto de corte enzimático, recomenda-se prestar atenção à seleção do ponto de corte enzimático, se necessárioA sobreposição entre as sequências de regiões de precursores de clonagem positiva e inversa e as sequências de genes específicosAumente a base perdida para restaurar o local enzimático original (veja o exemplo abaixo).

l Se os plasmídeos recombinantes forem usados ​​para a expressão de proteínas, observe a caixa de leitura do código ao projetar o precursor, e as sequências necessárias para a expressão e purificação de proteínas (por exemplo, iniciadores, sequências RBS, códons iniciais, códons terminais, etiquetas de proteínas, etc.) não serão danificadas.

Exemplo de desenho de precursor positivo (corte enzimático EcoR I):

Como mostrado acima, o veículo é cortado pela enzima Ecor I para formar uma extremidade saliente de 5’:

De acordo com o princípio de design acima, o cálculo começa a partir da extremidade 3', contando de volta de 16bp a 25bp (neste exemplo, os extremos de 20 bp se sobrepõem à mesma sequência) antes da sequência de primeiros específicos do segmento de destino. Certifique-se de que o valor Tm da área de sobreposição é consistente e VeriVeriVerifiqueque o par AT = 2°C e par GC = 4°C.

Os primeiros são os seguintes: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGN N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

Observação: Após a conexão de clonagem concluída com o desenho do precursor acima, o ponto de corte enzimático EcoR I desaparecerá (não mantém o ponto de corte enzimático).

Se o ponto de localização da enzima EcoR I for necessário para ser mantido, é necessário complementar a sequência de localização de identificação EcoR I faltante aattc entre a sequência de sobreposição de 20 bp no extremo do veículo e a sequência de precursor específico do segmento de destino, e o ponto de localização da enzima EcoR I permanece presente após a conclusão da conexão de clonagem (ponto de localização da enzima de retenção).

Especificamente: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Exemplo de desenho de introdutor inverso (corte enzimático Hind III):

Como mostrado acima, o veículo é cortado pela enzima Hind III para formar uma extremidade saliente de 5':

De acordo com o princípio de design acima, o cálculo começa a partir da extremidade 3', contando de volta de 16bp a 25bp (neste exemplo, os extremos de 20 bp se sobrepõem à mesma sequência) antes da sequência de primeiros específicos do segmento de destino. Certifique-se de que o valor Tm da área de sobreposição é consistente e VeriVeriVerifiqueque o par AT = 2°C e par GC = 4°C.

O desenho inverso é o seguinte: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCAN N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

Observação: Após a conclusão da conexão de clonagem com o desenho do precursor acima, o ponto de corte Hind III desaparecerá (o ponto de corte enzimático não é mantido).

Se a localização da enzima Hind III for necessária para ser mantida, é necessário complementar a sequência de localização de identificação de Hind III ausente agctt entre a sequência de sobreposição de 20 bp no extremo do veículo e a sequência de precursor específico do segmento de destino, com a localização da enzima Hind III ainda presente (localização da enzima de retenção).

Especificamente: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCAAgctt N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

Etapas operacionais para uma reação de clonagem perfeita:

NOTA: 2 × OneStep Cloning Mix contém o reforçador de ligação PEG é muito viscoso, mais viscoso quando tirado do frigorífico a baixa temperatura, pode ser colocado na mão para congelar por alguns minutos para aumentar a temperatura para reduzir a viscosidade (sem afetar a qualidade), mistura leve, instantaneamente coleta centrífuga para o fundo do tubo.

1. Estabeleça o sistema de reação de acordo com a tabela abaixo (pode ser preparado a temperatura ambiente usando tubos de PCR)

* O veículo geralmente usa 20-50 ng, a proporção de molar entre o segmento inserido e o veículo é melhor entre 2: 1-3: 1; Se o segmento inserido for menor de 200bp, a proporção de molar entre o segmento inserido e o veículo é de 5:1.

2. Misture suavemente, em 50°A reação C dura 15 minutos (pode ser realizada em um instrumento de PCR) e após a reação, a PCR é transformada diretamente ou mantida em -20 após colocação no gelo.°C. Os segmentos mais curtos, como 100bp-1kb, levam apenas 15 minutos para obter conversores suficientes, enquanto a conexão de segmentos mais longos pode prolongar o tempo de reação para 60 minutos.

3. Tome 5 μl do produto da reação para converter de acordo com as instruções das células sensíveis (se houver menos transformadores, todos os produtos podem ser convertidos e todo o líquido de conversão revestido).

Identificação de clonagem positiva:

Dependendo das circunstâncias específicas, a identificação por PCR de colônia pode ser selecionada, extraindo plasmídeos (número de mercadoria 31013-100) para identificação enzimática restritiva ou identificação de sequenciamento.

One Step Seamless Cloning Kit (em inglês)