Kit de ensaio CHIP (magnético)

Número da mercadoria：CH1581/CF1581/CM1581/CG1581

Condições de armazenamento：4°C Conservação

Descrição do produto

Os kits de teste CHIP são usados ​​para sedimentar fragmentos de cromatina ligados à proteína alvo por imunodecipitação e, finalmente, kits para detectar fragmentos de cromatina sedimentados por métodos como PCR ou Southern. Geralmente é usado para detectar se um fator de transcrição específico ou uma proteína de ligação ao DNA genômico, como histonas, e a sequência de DNA genômico específico esperada estão no mesmo complexo. O teste de ChIP permite concluir se a proteína alvo in vivo e o fragmento de DNA do genoma esperado estão no mesmo complexo. Os resultados do ChIP mostram claramente que essa ligação realmente ocorre dentro das células.

livroO kit de teste de ChIP utiliza contas HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-Magnetic como contas descarregadas do CHIP, com características de alta força de ligação e economia de tempo e eficiência. O kit fornece primeiros de controle pré-misturados que podem ser usados ​​para amplificar a sequência parcial correspondente do GAPDH humano com a sequência de primeiros: 5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’; 5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。

Passos operacionais (apenas para referência):

Otimização das condições de tratamento de ultra-som de amostras:

Prepare uma quantidade adequada de PBS pré-refrigerado, bem como PMSF de 100 mM. Faça um banho quente adequado no tampão de lysis SDS para que o SDS nele se dissolva completamente e misture.

2. As células são cultivadas em um prato de cultura celular de 250px com uma dose de 10 ml de líquido de cultura celular. Adicione uma quantidade moderada de formaldeído diretamente ao líquido de cultura celular no momento em que a ligação de proteína objetivo e DNA genômico ocorre e misture suavemente até a concentração final de 1%. Em seguida, incubar a 37ºC por 10 minutos para cruzar a proteína e o DNA genômico correspondente. Exemplo: Adicionar 270 ul de formaldeído 37% em um prato de cultura celular de 250px com 10 ml de líquido de cultura celular. Por favor, note que use formaldeído de alta qualidade e eficaz durante o período de uso. As células também podem ser cultivadas em pratos de Petri de células de 150px, e a dose da solução relevante deve ser ajustada proporcionalmente.

Adicione 1,1 ml de solução de glicina (10X) e misture suavemente. Deixe em temperatura ambiente por 5 minutos.

Coloque um prato de Petri com amostras de células em um banho de gelo. Excluir a cultura contendo formaldeído e glicina e tentar manter sem resíduos líquidos.

Coloque a temperatura ambiente por 5 minutos, diluindo 100mM de PMSF a 1mM com PBS pré-refrigerado, ou seja, PBS contendo PMSF de 1mM pré-refrigerado para um banho de gelo. As soluções aquáticas de PMSF devem ser formuladas frescamente, com uma meia-vida na fase aquática de cerca de 30 minutos.

Adicione 5-10ml de PBS pré-refrigerado (contendo PMSF 1mM), lave as células, absorva o líquido e tente manter sem resíduos líquidos.

Adicione 5-10ml de PBS pré-refrigerado (com PMSF 1mM) para lavar as células e absorver o líquido, tentando manter sem resíduos líquidos.

Adicione 1 ml de PBS pré-refrigerado (com PMSF 1mM), raspe as células com uma raspadura celular e colete-as em um tubo centrífugo. Se as células podem ser atingidas com uma arma, também podem ser atingidas com uma arma. As células são contadas e divididas em cerca de um milhão de células por tubo.

4 ° C, centrifugar 800-1000g por 1-2 minutos para precipitar completamente as células. Se a precipitação for insuficiente, o tempo de centrifugação pode ser prolongado adequadamente. Limpe-o para minimizar os resíduos líquidos.

Prepare a quantidade adequada de SDS Lysis Buffer contendo 1 mM de PMSF. A precipitação de 1 milhão de células da etapa anterior foi resuspendida com 0,2 ml de SDS Lysis Buffer contendo 1mM PMSF.

Incube no banho de gelo por 10 minutos para separar completamente as células.

Tratamento por ultra-som para cortar o DNA genômico, fazendo com que a maior parte do DNA quebre em tamanhos de 200-1000 bp, melhor se você puder controlar a maior parte dos fragmentos em 400-800 bp. Durante o processo de ultra-som, observe manter a amostra em um banho de gelo para manter a temperatura baixa. Os efeitos do corte por ultra-som podem ser detectados com eletroferese em gel de DNA-gonadotase convencional após a desentraçamento posterior. As condições do tratamento de ultra-som podem geralmente ser definidas para 10 segundos por vez, um total de 3-4 vezes, com a potência de 50W definida para 30% da potência máxima, usando uma cabeça de ultra-som de 2mm.

As configurações dos diferentes instrumentos de tratamento de ultra-som são diferentes, quando pesquisar as condições de ultra-som, você pode primeiro fixar outras condições, primeiro determinar por quanto tempo cada ultra-som não causará calor evidente, e depois pesquisar o número de vezes de ultra-som diferentes. Até encontrar o número mais adequado de ultra-sons pode fazer a maioria do genomaO DNA é dividido em tamanhos de 200-1000bp. Deve-se notar que o volume de ultra-som e a dose celular de cada vez devem ser fixados, caso contrário, uma condição de ultra-som relativamente fixa não pode ser usada para experimentos posteriores.

Nota: no genoma pós-ultra-somQuando o tamanho do DNA é testado, se o método de tintura em gel de gelatina é usado (ou seja, a adição de tintura de ácido nucleico ao tampão de carga) ou o método de tintura em gel, devido à eletroferese, o SDS se liga a tais tinturas para formar uma faixa anormal, a faixa geralmente está em torno de 500-1000bp, o que pode causar algum efeito no julgamento do tamanho do DNA do genoma pós-ultra-som. Recomenda-se a utilização do método de pós-tintura para a detecção do tamanho da faixa, o uso deste método não terá faixas anormais, não afeta o julgamento do tamanho do DNA do genoma pós-ultra-som, e o tamanho da faixa é mais preciso.

Adicione 8ul de NaCl 5M em uma amostra de 0,2 ml ultra-som e misture. Aquecer a 65°C durante 4 horas para remover a ligação entre proteínas e DNA genômico.

14. Adicionar Equilíbrio Tris de outros volumesbenzêniofeno，Vórtex misturado intensamente, seguido por centrifugação a 4ºC, cerca de 12.000 g por 5 minutos. Subir para outro tubo centrífugo.

Adicionar cloroformo de outro volume, vortex misturado fortemente, seguido de 4ºC, 12000g cerca de 5 minutos de centrifugação. Subir para outro tubo centrífugo.

Nota：A extração de fenocloroformo nas etapas 14 e 15 acima pode ser operada usando um kit de purificação de DNA.

Tomar uma pequena quantidade de líquido obtido através da extração de cloroformo de fenol ou kits de purificação de DNA, para o produto de extração de cloroformo de fenol pode ser tomado 5-10ul, para o produto de purificação de kits de purificação de DNA pode ser tomado 2-5ul, conduzir a eletroferese em gel de aglutinosa, observar o efeito de corte do DNA genômico do tratamento ultrassonico.

Imunoprecipitação da cromatina:

1. Após a otimização das condições de tratamento de ultra-som da amostra, para a amostra a ser testada de acordo comOtimização das condições de tratamento com ultra-som de amostrasmeio1-11Passos para operar e referência aos passos12 Tratamento por ultra-som.

2. Para amostras tratadas por ultra-som em 4ºC, 12000-14000g centrífuga 5min. Retire o limpo (cerca de 0,2 ml) em um tubo de centrifugação de 2 ml e coloque-o em um banho de gelo.

Prepare um buffer de diluição ChIP com 1 mM de PMSF. Adicione 1,8 ml de tampão de diluição ChIP contendo PMSF de 1 mM para diluir a amostra tratada por ultra-som para um volume final de 2 ml.

4. Tire a amostra de 20ul como Input para teste posterior. Tomar20ul HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-Perlas magnéticasAdicionarSolução de PBS ou TBST até 500ul para a limpeza por sopro, colocado no suporte magnético para lavar cuidadosamente a limpeza superior com um pipete e repetir a limpeza 2-3 vezes (para uma melhor redução da inespecificidade 1 também pode ser pré-tratado com 1-5% BSA ou leite degrassado 1 hora).

Limpar ou fechar.20ul HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-Perlas magnéticasPassos de adição3 As amostras restantes podem ser usadas simultaneamente com uma solução de amostra sem células como controle em branco, bem como amostras sem perlas como controle negativo, ou com anticorpos não relacionados como controle negativo. Rotar lentamente ou balançar a mistura a 4ºC por 30-60min para precipitar a proteína ou o complexo correspondente.

6. Coloque o tubo centrífugo acima que contém a amostra no suporte magnético para 10s. Remova a limpeza superior com muito cuidado e nunca toque no precipitado. Em seguida, o precipitado é lavado com a seguinte solução, com a dose de 1 ml de líquido de lavagem por vez, girando lentamente ou balançando para lavar 3-5min a 4 ° C por vez, em seguida, colocando-o no suporte magnético por 10 s. Remova cuidadosamente o líquido superior e não toque o precipitado.

(a) Low Salt Immune Complex Wash Buffer lavar uma vez.

(b) O tampão de lavagem do complexo imunológico de alto sal é lavado uma vez.

(c) LiCl Immune Complex Wash Buffer lavar uma vez.

(d) Lavar o TE Buffer duas vezes.

Nota：A precipitação obtida após a conclusão de todas as etapas de lavagem acima pode ser usada para a sequência genética para amplificação de PCR ou para a sequência genética para o teste Southern, ou para o teste Western, etc.

Três.Sequências genéticas destinadas à amplificação por PCR (por exemplo, produtos ChIP usados ​​para detectar sequências genéticas destinadas):

1. Prepare uma quantidade moderada de tampão de elução (1% SDS, 0,1 M NaHCO3).

2. Passos de conclusãoEtapas de Imunosedimentação第7Depois de completar todas as etapas de lavagem, adicione250ul Elution buffer。 Vortex misturado, a temperatura ambiente girar ou oscilar para continuar a lavar por 3-5min.

3. Coloque-o separado no suporte magnético por 10 segundos para transferir o líquido superior para um novo tubo centrífugo. Adicione 250 ul de tampão de elução. Vortex misturado, a temperatura ambiente girar ou oscilar para continuar a lavar por 3-5min.

4. Coloque no suporte magnético para separar por 10 segundos e retire a clara superior. Mescla com a definição superior obtida na etapa anterior, a etapa 3. Um total de cerca de 500ul.

Adicione 20ul de NaCl 5M ao soro superior de 500ul e misture. Aquecer a 65°C durante 4 horas para remover a ligação entre proteínas e DNA genômico. Para a amostra de 20ul obtida como entrada na etapa 2D, adicione 1ul de NaCl 5M, misture e aqueça a 65ºC durante 4 horas, igualmente para remover a cruzamento entre proteína e DNA genômico. Após a conclusão desta etapa, você pode continuar com as etapas seguintes ou congelar a -20ºC e continuar com as etapas seguintes no dia seguinte.

Nota1As amostras já podem ser usadasPCR， Pode-se tentar usar amostras de 1, 2, 5 ou 10ul como modelos para fins de detecção de genes por PCR. Neste momento, o efeito da PCR está relacionado com a quantidade de DNA que pode ser precipitado e se todo o sistema de amplificação da PCR é fácil de amplificar o gene de destino. Se os resultados da PCR forem descobertos como fracos, pode-se considerar a purificação e concentração da amostra para o teste de PCR através de etapas de purificação posteriores.

Nota2Normalmente, recomenda-se a purificação posterior.Para o teste de PCR, a entrada geralmente não requer etapas de purificação posteriores.

6. Adicione 10 ul de EDTA 0,5 M, 20 ul de Tris 1 M pH 6,5 e 1 ul de protease K 20 mg / ml em uma amostra de cerca de 520 ul. Incubar por 60 minutos a 45 ° C após a mistura.

7. Adicionar Equilíbrio Tris Volumebenzêniofeno，Vórtex misturado intensamente, seguido por centrifugação a 4ºC, cerca de 12.000 g por 5 minutos. Subir para outro tubo centrífugo.

Adicionar cloroformo de outro volume, misturar fortemente com o vórtice, em seguida, centrifugar por cerca de 4 ° C, 12.000 g por 5 minutos. Subir para outro tubo centrífugo.

Adicione 20 ug de glicogênio ou tRNA de levedura, adicione 1/10 do volume de NaAc 3M, pH 5,2 e adicione 2,5 vezes o volume de etanol anhidro. Depois de misturar, a precipitação a -70ºC dura não menos de 1 hora, ou a precipitação a -20ºC dura mais de 8 horas.

4 ° C, 12.000-14.000 g centrífuga por 10 minutos, cuidadosamente aspirar a maioria da limpeza superior, nunca tocar a precipitação.

Adicione cerca de 1 ml de 70% de etanol para lavar o precipitado. 4ºC, 12000-14000g centrífuga 10min, cuidadosamente absorver a maior parte da limpeza superior, nunca entrar em contato com a precipitação.

12. 4ºC, 12000-14000g centrífuga 1min, cuidadosamente absorver o líquido residual.

Resuspende o DNA com pequenas quantidades de TE ou água para a detecção de PCR do gene de destino. Os primeiros para PCR podem ser projetados em dois grupos, com Input como modelo para pré-explorar as condições de PCR correspondentes e selecionar um conjunto de primeiros mais eficazes para a detecção final de PCR. Em poucos casos, quando a faixa de PCR é muito fraca, a técnica de PCR aninhada pode ser usada para duas rodadas de amplificação.

Nota: PassosAs etapas 7 a 13 também podem ser usadas para purificar o DNA com um kit de purificação de DNA adequado.

Quatro.Produtos ChIP para teste Western (se o produto ChIP for usado para teste Western):

1. Seguir os passosImunosedimentação da cromatina第Passo 8: Depois de completar todas as etapas de lavagem, adicione 25 ul de tampão tipo proteína SDS-PAGE (1X). O tampão de superfície proteica SDS-PAGE (1X) pode ser preparado com a diluição de água do tampão de superfície proteica SDS-PAGE (5X). O banho ferve durante 10 minutos.

Tome 10-20ul para o teste ocidental.

Atenção:

1, deve ter sua própria resistência para ChIP, 37% formaldeído, PBS，PMSF，Elutioin (1% SDS, 0.1M NaHCO3)， Protease K, Glicogênio ou tRNA, Tris equilíbriobenzêniofenoO cloroformo,95% de etanol, 70% de etanol, NaAc 3M (pH5.2) e uma placa magnética, uma raspadura celular ou uma pala celular.

Processador de amostra de ultra-som (sonicator), também chamado de triturador de ultra-som ou triturador de células de ultra-som.

3, ao usar formaldeído, faça operação no armário de ventilação.

Este produto é limitado a fins de pesquisa científica de profissionais, não deve ser usado para diagnóstico clínico ou tratamento, não deve ser usado em alimentos ou medicamentos, não deve ser armazenado em casas comuns.

Para sua segurança e saúde, por favor, use roupas experimentais e luvas descartáveis.