Kit de expressão de proteína sem células - Edição Enhanced de Ligação Dienxofre - pó congelado

Número da mercadoria：P0243L

Condições de armazenamento：-80℃，1anoeficaz

Transporte de gelo seco. Após a abertura, os componentes responsivos sem expressão de proteínas celulares são colocados em -80 ° C para armazenamento. Para evitar o congelamento repetido, o líquido A e o líquido B podem ser divididos separadamente após congelamento rápido com nitrogênio líquido e armazenados em -80 ℃.

Componente do produto

Descrição do produto

O Kit de Síntese de Proteína Livre de Células (Cell-Free Protein Synthesis Kit)Este produto é baseado em soluções de células de E. coli para a síntese de proteínas in vitro. Este produto utilizaSubstâncias ativas como ribosomas, fatores de tradução, enzimas e outros no lito celular, ao mesmo tempo que adicionam energia,Nucleótidos, aminoácidos, sais inorgânicos, etc., transcrição reconstruída in vitroSistema de tradução. com DNA ouO RNA é um modelo que expressa proteínas. A expressão de proteínas sem células é uma forma de não depender de bactérias vivas,Capacidade de expressar proteínas em grandes quantidades com rapidez e flexibilidade em comparação com os sistemas tradicionais de expressão recombinanteMuitas vantagens:

Expressão rápida da proteína, 1 a 2 h para expressar a proteína de destino, 8 a 24 h para alcançar o máximoMuitas.

A expressão de proteína é alta, o gao máximo pode atingir proteínas acima de 3 mg / ml.

A resposta é simples e flexível, basta adicionar modelos de DNA ou RNA ao sistema de resposta.usarUma placa de 96 buracos ou um tubo centrífugo para a reação.

NOTA: Este produto pode expressar proteínas convencionais e é mais adequado para expressar proteínas que contêm ligações dienxofre.

Âmbito de aplicação

Os produtos Jin são limitados a fins de pesquisa científica de profissionais, não devem ser usados ​​para diagnóstico clínico ou tratamento, não devem ser usados ​​em alimentos ou medicamentos.

Instruções de operação

1. Construção Genética

A construção de genes de destino é essencial para a expressão de proteínas, e é recomendado usar o método de construção descrito abaixo. O gene de destino pode ser construído sobre o plasmidro positivo fornecido nesta caixa (o mapa do plasmidro é detalhado no arquivo interno do código 2D digitalizado no rótulo da embalagem externa), ou seja, do seguinte modo de construção; Também é compatível com plasmódeos da série PET que contêm o iniciador T7, mas não o manipulador da lactose (lac).

NOTA: Os plasmídeos que contêm manipuladores de lactose (como pET28a, etc.) podem ter um grande impacto no rendimento e não são recomendados para uso direto.

O esquema da sequência de DNA do plasmídio positivo é mostrado abaixo：

2. Preparação de modelos

Kits de síntese de proteínas sem células podem usar DNA ou mRNA como modelo para expressar proteínas recombinantes. Os modelos de DNA usados podem ser plasmídeos, produtos de PCR ou produtos de amplificação de anel de rolo RCA usando phi29.

2.1 Prósmitos: obtenção de plasmídeos adequados para reações sem células através da síntese de empresas genéticas ou subclones e extração de plasmídeos através da purificação de colunas;

2.2 Produtos da PCRProjeto de introdutor, introdutor positivo em torno de 200 bp acima do iniciador T7, introdutor inverso em torno de 200 bp abaixo do codião de terminação (incluindo terminador T7), amplificação do modelo, fragmentos lineares de DNA obtidos podem ser colocados diretamente no sistema de resposta sem células sem purificação. A função da base de 200 bp upstream e downstream é proteger fragmentos lineares de DNA da degradação endogênica por exoceses.

2.3 Produtos RCAUtilizando a polimerase phi29, hexatrônico aleatório para RCA de amplificação de anel rolante, o produto de DNA obtido pode ser usado diretamente em sistemas de resposta sem células.

2.4 A PCR e RCA podem ser combinadas com Golden Gate e Gibson Assembly, o que aumentará significativamente a velocidade e o fluxo de preparação de modelos de DNA.

2.5A quantificação precisa de modelos de DNA antes de serem usados; Recomenda-se o uso de kits de extração de plasmidos de alta qualidade para extração de plasmidos, evitando a introdução da RNase A; Os plasmídeos retornados pelas empresas de síntese genética precisam enfatizar o uso de métodos de purificação de coluna, caso contrário não podem ser usados ​​diretamente para reações sem células.

3. Sem expressão de proteínas celulares

3.1O líquido A e o líquido B necessários (proporção de volume 1:2) são calculados com base no volume total do sistema de reação, o reagente utilizado é adicionado no gelo em um recipiente de reação (por exemplo, um tubo centrífugo de fundo redondo de 2 ml) e misturado. O processo de operação requer o uso de luvas, máscaras e uma cabeça de pipeta sem fonte enzimática e um recipiente de reação para evitar a introdução de nucleosase.

Os sistemas de resposta sem células podem ser misturados de acordo com a tabela a seguir:

3.2Adicionando o DNA do modelo ao sistema de reação, a concentração final de adição do modelo de DNA é recomendada de 5 a 10 μg/ml para otimizar a quantidade de adição do modelo de DNA.

3.3Coloque o recipiente de reação em um agitador comum ou em um misturador termostato para a expressão de proteínas sem células, a temperatura de reação recomendada é de 25 a 30 ° C. Reduzir a temperatura diminui a taxa de síntese de proteínas, mas aumenta a solubilidade das proteínas. A produção de proteína máxima da pode ser alcançada com uma reação geral de cerca de 8 h, ou com uma reação durante a noite de 16 h. Quando a temperatura de reação diminui, o tempo de reação deve ser aumentado adequadamente.

3.4A expressão de proteínas sem células requer oxigênio suficiente e, quando um tubo de fundo redondo de 2 ml é usado como recipiente de reação, o sistema de reação não excede 100 μl. A reação sem proteína celular pode ser amplificada em proporção igual, e o sistema de reação amplificado requer o uso de recipientes de reação maiores, como garrafas agitadoras, etc., ao mesmo tempo em que a velocidade de rotação do leito agitador (200 rpm) é garantida.

4. Teste

No final da reação, tomar cerca de 1 μl de líquido de reação (para a detecção de toda a proteína) ou soro de reação (para a detecção de proteínas solúveis) para realizar a expressão da proteína para a detecção de eletróforese em gel de proteína SDS-PAGE.

5. Controle positivo

A proteína fluorescente verde sf-GFP está presente neste kit como um controle positivo e os resultados da reação podem ser observados diretamente ao olho nu. Após a expressão bem sucedida de sf-GFP, o sistema de resposta sem células será claramente verde.

Para uma quantificação precisa do sf-GFP, é possível testar com um calibrador enzimático (Ex/Em = 485/528 nm).