Extrator de ácido nucleico

TriZol Reagentes de extração de RNA total

Número do produto:R1000

Condições de armazenamento:Reagentes de extração de RNA total TriZolPode ser conservado a temperatura ambiente por 12 meses.Recomendamos manterEm ambientes de 2 a 8°C.

Notas importantes:

Este produto contém fenóis, que são tóxicos e corrosivos. Se inalar no corpo, entrar em contato com a pele, engolir, etc. pode causar envenenamento, queimaduras e outros danos físicos. Ao usar este produto, você deve usar itens de proteção, como luvas, máscaras, etc. Em caso de contato inadvertido, deve ser lavado imediatamente com uma grande quantidade de água e dirigido ao hospital para tratamento.

Introdução do produto:

TriZol Reagentes de extração de RNA totalÉ um reagente de extração de RNA total de amplo espectro. A operação experimental é rápida e conveniente, com cores claras e fácil de estratificar. Este reagente é amplamente utilizado para extrair RNA total de amostras de tecidos animais, materiais vegetais, vários micróbios e células de cultura. Este método tem um melhor efeito de separação em pequenas quantidades de tecido (50-100 mg) e células (5 x 106) e em grandes quantidades de tecido (≥1 g) e células (> 107). As amostras são totalmente fissuradas no reagente de extração de RNA total TriZol, ao mesmo tempo em que a integridade do RNA é garantida tanto quanto possível. Após a adição de centrifugação do cloroformo, a solução é dividida em três camadas: a fase aquática incolora superior, a camada média e a fase orgânica vermelha inferior, com o RNA distribuído na camada limpa superior. Após a coleta da camada superior, o RNA total pode ser recuperado por precipitação de isopropanol. O RNA total extraído é de boa integridade, livre de proteínas e poluição de DNA e pode ser usado em vários experimentos convencionais de biologia molecular, como: RT-PCR、Real-time RT-PCR、Northern blot、Dot Blot、 tradução externa, etc.

O reagente de extração de RNA total TriZol facilita a extração de vários tipos de RNA de diferentes tamanhos moleculares. Por exemplo, a eletroferese em gel de jonase de RNA extraída do fígado de ratos e tingida com bromoetilina, mostrou muitas faixas discontínuas de alto peso molecular (componentes de mRNA e hnRNA) entre 7 kb e 15 kb, com dois ribosomas vantajosos de ~5 kb (28S) e ~2 kb (18S) e RNA de baixo peso molecular entre 0,1 e 0,3 kb (tRNA, 5S). Quando o RNA extraído é diluído com TE, sua relação A260/A280 é ≥1,8. Observe que, se for eletroferese em gel de aglutinosa comum, a posição de 28S é de aproximadamente 2kb, 18S é de aproximadamente 1kb, a posição de gel de diferentes concentrações varia muito.

Atenção:

1.Utilização de amostrasDepois de homogenizar o reagente de extração de RNA total TriZol, se não imediatamente antes da adição de cloroformo, pode ser colocado a -70 ° C por mais de um mês. Preservado em 75% de precipitação de RNA em etanol, 2-8 ° C pode ser conservado por uma semana e 1 ano em condições de -20 ° C. A meia-vida do RNA é curta e facilmente degradável, e é recomendado realizar experimentos posteriores o mais rápido possível após a extração, como transcrição inversa de cDNA, Northern Blot, etc.

Se os experimentos downstream são muito sensíveis ao DNA, recomenda-se o tratamento do RNA com DNase livre I.

3.Reagentes próprios: cloroformo, isopropanol (Nova abertura ou extração75% de etanol (preparado com água tratada com DEPC), água livre de RNase ou água tratada com DEPC.

A empresa produz o Reagente de Extração de RNA Total TriZol de excelente qualidade, que pode substituir o Reagente Trizol da Invitrogen. A qualidade da extração é a mesma do experimento downstream*.

Etapas de extração de RNA: (leia as observações antes do experimento)

Dicas:

UsarO reagente de extração de RNA total TriZol deve usar luvas e protetores oculares para extrair RNA. Evite o contato com a pele e roupas. Operação concluída no armário de ventilação química. Evite a respiração. Sem instruções especiais, todas as operações devem ser realizadas em condições de temperatura ambiente de 15 a 30 ° C.

1. homogêneo

a) Organização vegetal:

Tomar tecido vegetal fresco em nitrogênio líquido moído adequadamente ou depois de processar o tecido vegetal triturado diretamente emTriZol Reagentes de extração de RNA totalMoer rapidamente, adicionar 1 ml de TriZol total RNA extração reagente a cada 50-100mg de tecido e misturar. Nota: o volume da amostra geralmente não deve exceder 10% do volume total do reagente de extração de RNA TriZol.

b) Organizações Animais:

Tomar fresco ouCongelar o tecido animal a -70 ° C para cortar o máximo possível, adicionar 1 ml de TriZol total RNA extração reagente para cada 30-100 mg de tecido e homologar para homologação. Ou adicionar 1 ml de reagente de extração de RNA total TriZol após moção em nitrogênio líquido. Nota: o volume da amostra geralmente não deve exceder 10% do volume total do reagente de extração de RNA TriZol.

c. Cultura de células de camada única:

Tente remover os resíduos limpos do líquido de cultura diretamente para o diâmetro1 ml de reagente de extração de RNA total TriZol foi adicionado a uma placa de cultivo de 3,5 cm para cobrir e repetidamente soprar as células fissuradas. A dose de extração de RNA total de TriZol necessária é determinada com base na área da placa em vez do número de células (por 10 cm2 mais 1 ml). Quando a dose de extração de RNA total de TriZol é insuficiente, pode levar à contaminação do DNA no RNA extraído.

Atenção:

As células de cultura de parede adesiva muitas vezes não podem * cair da garrafa (prato) de cultura, o que não significa que a fissura não * é o momento em que a membrana celular realmente * está aberta e está totalmente liberadaRNA， Continue a fazer isso.

d. Suspensão celular:

Recolha centrífuga de células. EmO reagente de extração de RNA total TriZol é soprado repetidamente com uma pipeta para dividir as células. Cada 5-10 vezes10⁶Células animais, plantas ou células de levedura ou 1 ml de bactérias por 1 x 107TriZol Reagentes de extração de RNA total. A lavagem das células deve ser evitada antes de adicionar o reagente de extração de RNA total TriZol, pois isso aumentaria a probabilidade de degradação do mRNA. A quebra de certas leveduras e bactérias pode exigir o uso de um amortiguador.

f) Sangue:

usarTriZol Reagentes de extração de RNA totalReagente LS.

2.A amostra de homogênio é colocada a temperatura ambiente após uma forte agitação.5 minutos para separar a nucleoproteína*.

3. Passos opcionais:

EmForça centrífuga de 12.000 rpm a 4°CCentrifugue durante 10 minutos e retire.

Se a amostra contém mais proteína, gordura, poliaçúcar ou músculo, os nódulos tubulares da planta podem ser removidos por centrifugação. Depois da centrifugação, a precipitação contém membrana externa celular, polysaccharides e alto peso molecular.DNA， Contém RNA. Quando se trata de amostras de tecido adiposo, a camada superior é uma grande quantidade de gordura deve ser removida. Tome a solução homogênea esclarecida para o próximo passo.

4.cada1mlTriZol Reagentes de extração de RNA totalAdicione 0,2 ml de cloroformo. Tape a tampa, agite fortemente por 15 segundos e coloque-a a temperatura ambiente por 2 a 3 minutos.

5.EmCentrífuga congelada de alta velocidade a 4 ° C a 12.000 rpm durante 10-15 minutos. A mistura pós-centrifugação é dividida em três camadas: a camada inferior do cloroformo de fenol orgânico vermelho, a camada média e a camada superior da amostra de água incolor. O RNA está presente na amostra de água sem exceção. A capacidade da camada de amostra é de aproximadamente 50-60% da capacidade total do reagente de extração de RNA de TriZol adicionado. (As camadas orgânicas e intermediárias são proteínas e DNA e, se necessário, entre em contato conosco para solicitar o método de extração).

6.Transferir a camada de amostra de água para um tubo centrífugo limpo e adicionar isopropanol de volume equivalente. Posicionamento à temperatura ambiente após mistura invertidaDez minutos.

A precipitação de RNA é geralmente invisível antes da centrifugação, que forma uma precipitação gelatinosa no lado do tubo e no fundo do tubo.

7.A temperatura ambiente ou4°C 12.000 rpm Centrifugar durante 10 minutos e descartar.

8.Inscrever75% de lavagem de etanol. A precipitação é lavada com 1 ml de etanol 75% por cada 1 ml de reagente de extração de RNA total TriZol.

9.A temperatura ambiente ouCentrifugue a 4°C por 12.000 rpm durante 3 minutos, descartando o limpo, prestando atenção para não perder a precipitação de RNA.

Observação: a pequena quantidade de líquido restante pode ser centrifugada por um breve tempo e, em seguida, aspirada com a cabeça da pistola, cuidado para não absorver o precipitado.

10.Temperatura ambiente2-3 minutos para secar. Adicione 30-100 μl de água livre de RNase, dissolva completamente o RNA e mantenha o RNA obtido a -70 ° C para evitar a degradação.

Observação: a pequena quantidade de líquido restante pode ser centrifugada por um breve tempo e, em seguida, aspirada com a cabeça da pistola, cuidado para não absorver o precipitado.