Número da mercadoria：B1013/4/5/6

Condições de armazenamentoArmazenamento: -20 ℃, o componente A precisa ser protegido da luz para evitar o congelamento repetido.

Componente do produto：

Apresentação do Produto

Uma característica significativa da apoptose é a degradação do ADN cromossómico celular, que é muito específica e regular, resultando em fragmentos de ADN de diferentes comprimentos de 180 bp-200 bp em números inteiros, que se manifestam como mapas de escada em gelatina específicos apresentados em eletroferese. Utilizando o método TUNEL, este kit incorpora YF com a catálise terminal 3´-OH da desoxinucleotidiltransferase terminal (TdT) para quebrar o DNA em células apoptóticas. ®/ Cy-dUTP，YF ®/ O DNA marcado com Cy-dUTP pode ser observado diretamente por microscópio fluorescente ou quantificado por citométria de fluxo. O método TUNEL pode detectar seletivamente células apoptoticas, em vez de células necrotizadas ou células com ruptura da cadeia de DNA devido à radiação e ao tratamento com medicamentos. O dUTP marcado (por exemplo, gaoxin-dUTP, wuxin-dUTP) pode ser testado diretamente in situ e é um meio de detecção mais rápido e direto.

Este kit é amplamente utilizado para detectar apoptose celular em cortes congelados ou de parafina, bem como para detectar apoptose celular em cultura ou em suspensão. Detecção seletiva de células apoptoticas, em vez de células necrotizadas ou células com ruptura da cadeia de DNA causada por radiação e medicamentos. Este kit de teste detecta apoptose celular, demora pouco tempo, apenas uma reação de coloração de um passo, pode ser detectado após a lavagem.

Uso

Materiais experimentais (próprios)

Tampon PBS (pH ~ 7,4)

0,4% Triton X-100 (formulação PBS)

0,1% Triton X-100 (formulação de PBS com 5 mg/mLBSA)

4% poliformaldeído (formulação PBS)

Caneta de imunocomposição

Solvente de desiceração (amostra de corte de parafina)

Reagentes relacionados ao tratamento de cortes de parafina

Comprimidos de extinção antifluorescente

ddH2O

Projeto Experimental

A. Controle positivo

O processamento DNaseI prepara um slide de comparação positiva. DNase I pode digerir DNA de cadeia única ou dupla que expõe o terminal 3'-OH, causando apoptose humana. Faça cada experimento uma vez. (Para verificar se há problemas com a operação do experimento e o kit)

B. Controle negativo

Utilização sem TdT O túnel da enzima Reação Buffer， Substituir TdT com ddH2O Enzyme。 (principalmente para excluir a coloração não específica causada pela apoptose da célula, o processo operacional, etc.; e ajustar a intensidade da exposição da fotografia.)

C. Grupo de Tratamento Experimental

O grupo experimental funciona normalmente de acordo com as instruções.

D. Grupo de controle experimental

O grupo experimental funciona normalmente de acordo com as instruções.

Passos experimentais

1 Preparação da amostra:

(1) Para células de adesão ou revestimento celular

Limpe o PBS uma vez.

NOTA: Se você está preocupado com a adesão das células com a mancha celular, você pode secar a amostra para que as células sejam mais firmes.

Fixação: adicione a quantidade apropriada de poliformaldeído de 4% (formulação de PBS), fixação a 4 ° C por 30 min. Limpe o PBS duas vezes.

c. Permeabilidade: adicione uma quantidade moderada de 0,4% TritonX-100 (formulação PBS) e permeabilidade a temperatura ambiente por 20min. Limpe o PBS duas vezes.

Passo 2: Reação do túnel.

(2) Para células em suspensão ou suspensão celular

Coleta de células (3-5 x 10)⁶1 célula), centrífuga 1000rpm em 5min, limpeza com PBS 2 vezes.

b. Fixação: Adicionar a quantidade adequada de 4% poliformaldeído (formulação PBS) para ressuspender completamente as células, 4 ° C para fixar 30 min. 2000 rpm centrifugação 5min, PBS limpeza 2 vezes.

c. Permeabilidade: adicione uma quantidade moderada de 0,4% TritonX-100 (formulação PBS) e permeabilidade a temperatura ambiente por 20min. 2000 rpm centrifugação 5min, PBS limpeza 2 vezes.

Passo 2: Reação do túnel.

(3) corte de tecido de parafina

a. Coloque as fatias de parafina no suporte de corte e coloque as fatias no forno a 60 ° C por 60 minutos.

b. Desceragem e hidratação: coloque a amostra de corte em bifenilo I (10min) bifenilo II (10min) 100% etanol I (5min) 100% etanol II (5min) 95% etanol (5min) 90% etanol (5min) 80% etanol (5min) 70% etanol (5min) ddH2O para lavar 5min, lavar 2 vezes.

NOTA: O bifenilo é tóxico e volátil, faça isso no armário de ventilação.

c. Use papel de filtro para secar o líquido ao redor da amostra de corte, com uma caneta de imunocomposição para um bom contorno da amostra, a fim de descer com a marca.

Nota: Se o círculo do contorno da caneta imunohimósica for descoberto em operações experimentais posteriores, é necessário pintar novamente em tempo útil.

d. Permeabilidade: diluir 2 mg / ml de solução de Proteinase K com PBS até a concentração final de 40 µg / mL em uma proporção de 1: 50, adicionar 100 µL gotejando em cada amostra para que a solução cobra toda a área da amostra e incubar a 37 ° C por 30 min.

NOTA: A Proteinase K penetra a membrana celular e a membrana nuclear, permitindo que o reagente de coloração das etapas seguintes entre plenamente no núcleo celular para reagir e melhorar a eficiência da marcação. O tempo de incubação excessivo aumenta o risco de cortes de tecido serem retirados da placa portadora durante as etapas de lavagem subsequentes, e muito curto pode causar um tratamento inadequado de permeabilidade e afetar a eficiência da marcação. Para obter melhores resultados, a concentração, o tempo de incubação e a temperatura da Proteinase K devem ser otimizados de acordo com os diferentes tipos de amostras de tecido.

E. Mergulhe a amostra de corte em 1 x PBS para lavar três vezes, 5min cada vez, com papel de filtro para aspirar o excesso de líquido e coloque a amostra tratada em uma caixa úmida para manter úmida.

NOTA: Esta etapa deve ser lavada com a Proteinase K, caso contrário, interferirá gravemente com a resposta de marcação subsequente.

Passo 2: Reação do túnel.

(4) corte de tecido congelado

a. Fixar: retirar a fatia congelada e voltar a aquecer a temperatura ambiente. Immergir a amostra de corte em poliformaldeído de 4% (formulação PBS) e fixar a temperatura ambiente por 30 min. Mergulhe a amostra em 1 x PBS e lavá-la três vezes por 10min cada vez.

Nota: se você está preocupado com a limpeza do formaldeído não é limpa, afetar o efeito final de coloração. Após a conclusão da fixação do formaldeído, a quantidade adequada de ácido glicano de 2 mg / mL pode ser adicionada para a limpeza por 10 min, neutralizar o líquido fixante residual e, em seguida, realizar a limpeza com PBS.

b. Usar papel de filtro para secar o líquido ao redor da amostra de corte, usar uma caneta de imunocomposição para um bom contorno da amostra, a fim de descer com a marca.

Nota: Se o círculo do contorno da caneta imunohimósica for descoberto em operações experimentais posteriores, é necessário pintar novamente em tempo útil.

c. Permeabilidade: diluir 2 mg / ml de solução de Proteinase K com PBS até a concentração final de 40 µg / mL em uma proporção de 1: 50, adicionar 100 µL gota a gota em cada amostra para que a solução cobra toda a área da amostra e incubar a 37 ° C por 20 min.

NOTA: Proteinase K pode penetrar a membrana celular e a membrana nuclear, permitindo assim que as etapas seguintes do reagente de coloraçãoEnter plenamente no núcleo celular para reagir, melhorando a eficiência da marcação. O tempo de incubação excessivo aumenta o risco de cortes de tecido serem retirados da placa portadora durante as etapas de lavagem subsequentes, e muito curto pode causar um tratamento inadequado de permeabilidade e afetar a eficiência da marcação. Para obter melhores resultados, a concentração, o tempo de incubação e a temperatura da Proteinase K devem ser otimizados de acordo com os diferentes tipos de amostras de tecido. Se a otimização da concentração de Proteinase K e o tempo de incubação ainda não podem melhorar o efeito da coloração, você pode escolher imergir a amostra em 1% Triton X-100 (formulação PBS) e estimular a temperatura ambiente em 3-5 min; Em seguida, a amostra de corte é mergulhada em 1 x PBS e lavada três vezes por 5min cada vez.

D. Mergulhe a amostra de corte em 1 x PBS para lavar três vezes, 5min cada vez, com papel de filtro para aspirar o excesso de líquido e coloque a amostra tratada em uma caixa úmida para manter úmida.

NOTA: Esta etapa deve ser lavada limpa com ProteinaseK, caso contrário interferirá gravemente com a resposta de marcação subsequente.

Passo 2: Reação do túnel.

(5) Tratamento positivo (somente o controle positivo faz esta etapa, outras amostras fazem a etapa de reação TUNEL diretamente)

Diluir 10 x DNase I Buffer em 1 x DNase I Buffer de reposição com ddH2O em uma proporção de 1:10.

b. Adicione 100 µL de 1 x DNase I Buffer na amostra tratada, cobrindo toda a área da amostra e equilibrando a temperatura ambiente por 5 min.

c. Diluir a DNase I (2 U/μL) a uma concentração final de 20 U/mL em 1:100 com 1 x tampão DNase I.

d. Eliminar o tampão, adicionar 100 μL de líquido de trabalho DNaseI à concentração de 20 U / mL e incubar a temperatura ambiente por 15 min.

Elimine a DNase I e limpe com PBS duas vezes.

Passo 2: Reação do túnel.

Reação do túnel

(1) Preparação do líquido de reação TUNEL (ou seja, uso pronto)

(2) Para células de parede, revestimentos celulares ou cortes de tecido

a. Adicione 50 μL de líquido de reação TUNEL a cada amostra para que o líquido de reação cobra uniformemente a amostra. Tempo apropriado para incubação à luz a 37 ℃ (as células recomendam o tempo de coloração de 15-30 dias, o tempo de coloração do tecido é recomendado de 1 h).

Nota: 50 μL O líquido de reação TUNEL é adequado para revestimentos, cortes ou placas de 96 buracos (outras placas diferentes podem ajustar adequadamente o volume do líquido de reação TUNEL para cobrir as células). Se a amostra a ser testada é um revestimento, um corte ou uma placa de 24 buracos, uma placa de 12 buracos ou uma placa de 6 buracos, você pode usar uma película anti-evaporação, ou tentar usar um saco auto-fechado ou outro material apropriado para cortar em pedaços de plástico redondo ligeiramente menores em proporção aos buracos, gotejando o líquido de reação TUNEL e cobrindo a amostra para evitar a evaporação do líquido de reação TUNEL e fazer com que o líquido de reação TUNEL cobra uniformemente a amostra.

b. Eliminar o líquido de reação TUNEL, depois de limpar 2 vezes com PBS e 0,1% Triton X-100 (Formulação de PBS, que contém 5mg / mLBSA) limpar 3 vezes por 5min cada vez, de modo que os marcadores não reagidos livres podem ser removidos mais limpos.

c. (Opcional) Adicione a quantidade apropriada de 5 μg/mL de DAPI para cada amostra, protegida da luz à temperatura ambienteincubação5min。 Após a coloração, descarte a coloração DAPI e limpe com PBS 2 vezes por 5min cada vez.

d. (opcional) vedação de corte: cada gota de amostra adiciona 20 μL de comprimido de extinção antifluorescente (antifluorescente)Os comprimidos de fechamento de extinção podem não ser aplicáveis ​​a certos corantes, recomenda-se uma combinação de teste pré-experimental antes do experimentoSexual), tapar o vidro, bater suavemente no vidro com a extremidade morna da pinça, remover a bolha para que o vidro wantodo。

e. Remover o excesso de líquido com papel de filtro e adicionar 100 μL à área da amostra PBS mantém a amostra úmida,Observação imediata sob microscópio fluorescente.

(3) Para células em suspensão ou suspensão celular

a. Cada tubo de amostra adicionar 50 μL LTUNEL líquido de reação suavemente ressuspender as células e incubar à luz a 37 ℃15-30min。 Suspende as células suavemente a cada 10 min com um pipite de trace.

b. 2000 rpm centrífuga 5min, descartar o líquido de reação TUNEL, com 0,1% Triton X-100(Preparação de PBS, contendo 5mg/mL) BSA) limpar 2 vezes, 5min cada vez, assim nadarOs marcadores não reagidos podem ser removidos de forma mais limpa.

c. Cada tubo de amostra adicionar 100 μL de DAPI a concentração de 5 μg / mL e incubar a temperatura ambiente para 5 min.

Adicionando 400 μL PBS ressuspende as células imediatamente após a detecção com citométria de fluxo ou a aplicação de um revestimento.Observação sob microscópio fluorescente.

Precauções

Antes de usar, centrifuge o produto instantaneamente para o fundo do tubo e faça uma experiência posterior.

O tempo de coloração pode ser reduzido adequadamente quando a coloração de fundo é mais pesada ou não específica.

Recomenda-se aumentar o grupo de controle negativo e o grupo de controle positivo.

Use máscaras e luvas quando usar o componente A, por exemplo, em contato com a pele, por favor, enxague imediatamente com muita água.

Existem problemas de extinção de corantes fluorescentes, por favor, tente evitar a luz para retardar a extinção de fluorescência.

Este produto é limitado à pesquisa científica e não deve ser usado para diagnóstico clínico ou tratamento, não deve ser usado em alimentos ou medicamentos e não deve ser armazenado em casas comuns.

Para sua segurança e saúde, por favor, use roupas experimentais e luvas descartáveis para operação.