Número da mercadoria：B1013/4/5/6

Condições de armazenamento：Armazenamento de -20 ° C, o componente A precisa ser protegido da luz para evitar o congelamento repetido.

Componente do produto：

Apresentação do Produto

Uma característica significativa da apoptose celular é o cromossoma celular.A degradação do DNA, que é muito específica e regular, resulta em diferentes comprimentos de fragmentos de DNA de 180 bp-200 bp em números inteiros que se manifestam como mapas escaleiras específicos apresentados em eletróforese em gel de aglutinação. Utilizando o método TUNEL, este kit incorpora YF com a catálise terminal 3´-OH da desoxinucleotidiltransferase terminal (TdT) para quebrar o DNA em células apoptóticas. ®/ Cy-dUTP，YF ®/ O DNA marcado com Cy-dUTP pode ser observado diretamente por microscópio fluorescente ou quantificado por citométria de fluxo. O método TUNEL pode detectar seletivamente células apoptoticas, em vez de células necrotizadas ou células com ruptura da cadeia de DNA devido à radiação e ao tratamento com medicamentos. marcação dUTP (comoTerraGaoxino dUTP,vidaWu-dUTP）， A detecção in situ pode ser realizada diretamente, o que é um meio de detecção mais rápido e direto.

Este kit é amplamente utilizado para detectar apoptose celular em cortes congelados ou de parafina, bem como para detectar apoptose celular em cultura ou em suspensão. Detecção seletiva de células apoptoticas em vez de células necroticas ou causadas por radiação e medicamentosCélulas com cadeias de DNA quebradas. Este kit de teste detecta apoptose celular, demora pouco tempo, apenas uma reação de coloração de um passo, pode ser detectado após a lavagem.

Uso

Materiais experimentais (próprios)

Tampon PBS (pH ~ 7,4)

0,4% Triton X-100 (formulação PBS)

0,1% Triton X-100 (formulação de PBS com 5 mg/mLBSA)

4%muitoJu Quan（Preparação PBS

Caneta de imunocomposição

Solvente de desiceração (amostra de corte de parafina)

Reagentes relacionados ao tratamento de cortes de parafina

Comprimidos de extinção antifluorescente

ddH2O

Projeto Experimental

A. Controle positivo

O processamento DNaseI prepara um slide de comparação positiva. A DNase I pode digerir DNA de cadeia única ou de cadeia dupla exposto ao terminal 3'-OH, causando apoptose humana. Faça cada experimento uma vez. (Para verificar se há problemas com a operação do experimento e o kit)

B. Controle negativo

Uso não incluídoO TdT Enzyme Tunnel Reaction Buffer substitui a enzima TdT por ddH2O. (principalmente para excluir a coloração não específica causada pela apoptose da célula, o processo operacional, etc.; e ajustar a intensidade da exposição da fotografia.)

C. Grupo de Tratamento Experimental

O grupo experimental funciona normalmente de acordo com as instruções.

D. Grupo de controle experimental

O grupo experimental funciona normalmente de acordo com as instruções.

Passos experimentais

1 Preparação da amostra:

（1) Para as células adesivas ou revestimentos celulares

Limpe o PBS uma vez.

NOTA: Se você está preocupado com a adesão das células com a mancha celular, você pode secar a amostra para que as células sejam mais firmes.

b. Fixo: adicione a quantidade apropriada de 4%muitoJu Quan（Preparação PBS), fixação a 4 ° C por 30min. Limpe o PBS duas vezes.

c. Permeabilidade: adicione uma quantidade moderada de 0,4% TritonX-100 (formulação PBS) e permeabilidade a temperatura ambiente por 20min. Limpe o PBS duas vezes.

Passo 2: Reação do túnel.

（2) Para células suspensas ou suspensão celular

Coleta de células (3-5 x 10)⁶uma célula),1000rpm centrífuga 5min, PBS limpeza 2 vezes.

b. Fixo: adicione a quantidade apropriada de 4%muitoJu Quan（Preparação de PBS) totalmente ressuspender as células e fixar a 4 ° C por 30 min. 2000 rpm centrifugação 5min, PBS limpeza 2 vezes.

c. Permeabilidade: adicione uma quantidade moderada de 0,4% TritonX-100 (formulação PBS) e permeabilidade a temperatura ambiente por 20min. 2000 rpm centrifugação 5min, PBS limpeza 2 vezes.

Passo 2: Reação do túnel.

（3) corte de tecido de parafina

a. Coloque as fatias de parafina no suporte de corte e coloque as fatias no forno a 60 ° C por 60 minutos.

b. Desceragem e hidratação: coloque a amostra de corte em bifenilo I (10min) bifenilo II (10min) 100% etanol I (5min) 100% etanol II (5min) 95% etanol (5min) 90% etanol (5min) 80% etanol (5min) 70% etanol (5min) ddH2O para lavar 5min, lavar 2 vezes.

NOTA: O bifenilo é tóxico e volátil, faça isso no armário de ventilação.

c. Use papel de filtro para secar o líquido ao redor da amostra de corte, com uma caneta de imunocomposição para um bom contorno da amostra, a fim de descer com a marca.

Nota: Se o círculo do contorno da caneta imunohimósica for descoberto em operações experimentais posteriores, é necessário pintar novamente em tempo útil.

d. Permeabilidade: diluir 2 mg / ml de solução de Proteinase K com PBS até a concentração final de 40 µg / mL em uma proporção de 1: 50, adicionar 100 µL gotejando em cada amostra para que a solução cobra toda a área da amostra e incubar a 37 ° C por 30 min.

Nota:A Proteinase K penetra a membrana celular e a membrana nuclear, permitindo que o reagente de coloração das etapas seguintes entre plenamente no núcleo celular para reagir, aumentando a eficiência da marcação. O tempo de incubação excessivo aumenta o risco de cortes de tecido serem retirados da placa portadora durante as etapas de lavagem subsequentes, e muito curto pode causar um tratamento inadequado de permeabilidade e afetar a eficiência da marcação. Para obter melhores resultados, a concentração, o tempo de incubação e a temperatura da Proteinase K devem ser otimizados de acordo com os diferentes tipos de amostras de tecido.

E. Mergulhe a amostra de corte em 1 x PBS para lavar três vezes, 5min cada vez, com papel de filtro para aspirar o excesso de líquido e coloque a amostra tratada em uma caixa úmida para manter úmida.

Nota: Este passo deve serA Proteinase K é lavada limpa, caso contrário interferirá gravemente com a resposta de marcação subsequente.

Passo 2: Reação do túnel.

（4) corte de tecido congelado

a. Fixar: retirar a fatia congelada e voltar a aquecer a temperatura ambiente. Mergulhe a amostra em 4%muitoJu Quan（Preparação de PBS), a temperatura ambiente é fixada por 30min. Mergulhe a amostra em 1 x PBS e lavá-la três vezes por 10min cada vez.

Nota: se você está preocupado com a limpeza do formaldeído não é limpa, afetar o efeito final de coloração. Pode ser adicionada quantidade adequada após a conclusão da fixação formaldeído2mg / mlGanÁcidoLimpeza10min， Neutralizar o líquido fixo residual e, em seguida, realizar a limpeza com PBS.

b. Usar papel de filtro para secar o líquido ao redor da amostra de corte, usar uma caneta de imunocomposição para um bom contorno da amostra, a fim de descer com a marca.

Nota: Se o círculo do contorno da caneta imunohimósica for descoberto em operações experimentais posteriores, é necessário pintar novamente em tempo útil.

c. Permeabilidade: diluir 2 mg / ml de solução de Proteinase K com PBS até a concentração final de 40 µg / mL em uma proporção de 1: 50, adicionar 100 µL gota a gota em cada amostra para que a solução cobra toda a área da amostra e incubar a 37 ° C por 20 min.

Nota:A Proteinase K penetra a membrana celular e a membrana nuclear, permitindo assim a coloração dos reagentes para as etapas seguintesEnter plenamente no núcleo celular para reagir, melhorando a eficiência da marcação. O tempo de incubação excessivo aumenta o risco de cortes de tecido serem retirados da placa portadora durante as etapas de lavagem subsequentes, e muito curto pode causar um tratamento inadequado de permeabilidade e afetar a eficiência da marcação. Para obter melhores resultados,A concentração, o tempo de incubação e a temperatura da proteinase K devem ser otimizados de acordo com os diferentes tipos de amostras de tecido. Se a otimização da concentração de Proteinase K e o tempo de incubação ainda não podem melhorar o efeito da coloração, você pode escolher imergir a amostra em 1% Triton X-100 (formulação PBS) e estimular a temperatura ambiente em 3-5 min; Em seguida, a amostra de corte é mergulhada em 1 x PBS e lavada três vezes por 5min cada vez.

D. Mergulhe a amostra de corte em 1 x PBS para lavar três vezes, 5min cada vez, com papel de filtro para aspirar o excesso de líquido e coloque a amostra tratada em uma caixa úmida para manter úmida.

Nota: Este passo deve serProteinaseK é lavado limpo, caso contrário interferirá gravemente com a resposta de marcação subsequente.

Passo 2: Reação do túnel.

（5) Tratamento positivo (somente o controle positivo faz esta etapa, outras amostras fazem a etapa de reação TUNEL diretamente)

Diluir 10 x DNase I Buffer em 1 x DNase I Buffer de reposição com ddH2O em uma proporção de 1:10.

b. Adicione 100 µL de 1 x DNase I Buffer na amostra tratada, cobrindo toda a área da amostra e equilibrando a temperatura ambiente por 5 min.

c. Diluir a DNase I (2 U/μL) a uma concentração final de 20 U/mL em 1:100 com 1 x tampão DNase I.

d. Eliminar o tampão, adicionar 100 μL de líquido de trabalho DNaseI à concentração de 20 U / mL e incubar a temperatura ambiente por 15 min.

Elimine a DNase I e limpe com PBS duas vezes.

Passo 2: Reação do túnel.

Reação do túnel

（1) Preparação do líquido de reação TUNEL (pronta para uso)

（2) Para células adesivas, revestimentos celulares ou cortes de tecido

a. Adicione 50 μL de líquido de reação TUNEL a cada amostra para que o líquido de reação cobra uniformemente a amostra. Tempo apropriado para incubação à luz a 37 ℃ (as células recomendam o tempo de coloração de 15-30 dias, o tempo de coloração do tecido é recomendado de 1 h).

Nota:50 μL de reagente TUNEL é adequado para revestimentos, cortes ou placas de 96 buracos (outras placas de buracos diferentes podem ajustar adequadamente o volume de reagente TUNEL para cobrir as células). Se a amostra a ser testada é um revestimento, um corte ou uma placa de 24 buracos, uma placa de 12 buracos ou uma placa de 6 buracos, você pode usar uma película anti-evaporação, ou tentar usar um saco auto-fechado ou outro material apropriado para cortar em pedaços de plástico redondo ligeiramente menores em proporção aos buracos, gotejando o líquido de reação TUNEL e cobrindo a amostra para evitar a evaporação do líquido de reação TUNEL e fazer com que o líquido de reação TUNEL cobra uniformemente a amostra.

Depois de descartar o líquido de reação TUNEL, limpar o PBS 2 vezes, e depois limpar 3 vezes com 0,1% Triton X-100 (formulação de PBS, que contém 5mg / mLBSA) por 5 minutos cada vez, para que os marcadores não reagidos livres possam ser limpos.

c. (Opcional) Adicione a quantidade apropriada de 5 μg/mL de DAPI para cada amostra, protegida da luz à temperatura ambienteincubação5min。 Após a coloração, descarte a coloração DAPI e limpe com PBS 2 vezes por 5min cada vez.

d. (opcional) vedação de corte: cada gota de amostra adiciona 20 μL de comprimido de extinção antifluorescente (antifluorescente)O comprimido de vedação de extinção pode não ser aplicável a certos corantes, o teste pré-experimental de correspondência é recomendado antes do experimento), tapar o vidro, bater suavemente no vidro com a extremidade opaca da pinça e remover as bolhas para que o vidro

Wan todo.

e. Absorber o excesso de líquido com papel de filtro e adicionar 100 μL de PBS à área da amostra para manter a amostra úmida,Observação imediata sob microscópio fluorescente.

（3) Para células suspensas ou suspensão celular

a. Cada tubo de amostra adicionar 50 μL LTUNEL líquido de reação suavemente ressuspender as células e incubar à luz a 37 ℃15-30min。 Suspende as células suavemente a cada 10 min com um pipite de trace.

b. 2000 rpm para centrifugação em 5min, eliminando o líquido de reação TUNEL com 0,1% Triton X-100（A formulação de PBS, que contém 5 mg / mL de BSA) é limpa 2 vezes por 5 min cada vez, de modo que os marcadores não reagidos livres podem ser removidos mais limpos.

c. Cada tubo de amostra adicionar 100 μL de DAPI a concentração de 5 μg / mL e incubar a temperatura ambiente para 5 min.

d. Adicionar 400 μL de PBS às células em suspensão imediatamente após a detecção com citométria de fluxoObservação sob microscópio fluorescente.

Precauções

Antes de usar, centrifuge o produto instantaneamente para o fundo do tubo e faça uma experiência posterior.

O tempo de coloração pode ser reduzido adequadamente quando a coloração de fundo é mais pesada ou não específica.

Recomenda-se aumentar o grupo de controle negativo e o grupo de controle positivo.

Use máscaras e luvas quando usar o componente A, por exemplo, em contato com a pele, por favor, enxague imediatamente com muita água.

Existem problemas de extinção de corantes fluorescentes, por favor, tente evitar a luz para retardar a extinção de fluorescência.

Este produto é limitado à pesquisa científica e não deve ser usado para diagnóstico clínico ou tratamento, não deve ser usado em alimentos ou medicamentos e não deve ser armazenado em casas comuns.

Para sua segurança e saúde, por favor, use roupas experimentais e luvas descartáveis para operação.