Kit de ELISA do receptor de Interquina-6

Kit de ELISA do receptor de Interquina-6

Kit de ELISA do receptor de Interquina-6É uma ferramenta usada em pesquisas científicas para a detecção quantitativa do teor de receptores de interfeína-6 em amostras biológicas. A IL-6R desempenha um papel fundamental na imunomodulação e na resposta inflamatória, e a detecção de seus níveis é importante para os estudos relevantes.

1. Princípio de testeA caixa de teste usa mais o método de imunoassorção ligada a centrigenase de anticorpos duplos. Anticorpos específicos contra IL-6R são pré-embalados em placas enzimáticas. Após a adição da amostra, IL-6R na amostra se liga à especificidade de anticorpos de fase sólida. Em seguida, um anticorpo anti-IL-6R marcado por enzima é adicionado, que forma um complexo "anticorpo de fase sólida - IL-6R - anticorpo marcado por enzima" com o IL-6R ligado ao anticorpo de fase sólida. Depois de uma lavagem adequada, a substância não ligada é removida, a solução de substrato (como TMB) é adicionada e, sob a catalisação enzimática, o substrato é colorido com uma cor profunda proporcional ao conteúdo de IL-6R na amostra. A concentração de IL-6R na amostra é calculada medindo a absorção a um comprimento de onda específico (geralmente 450 nm) através de um escalómetro enzimático, em comparação com a curva padrão.

2. Composição do Kit

• Placa enzimática96 ou 48 orifícios, pré-embalados com anticorpos anti-IL-6R, são veículos para a reação.

• Produtos padrãoGeralmente, é congelado e tem duas garrafas. A diluição padrão é necessária antes da administração e diluída em diferentes gradientes de concentração, como 0, 31,2, 62,5, 125, 250, 500, 1000 pg / mL, etc., para desenhar curvas padrão.

• amostra xi liberaçãoUsado para diluir as amostras a serem testadas com concentrações excessivas para garantir que a concentração da amostra esteja dentro da faixa de teste do kit.

• Anticorpos enzimáticosAnticorpos anti-IL-6R marcados por HRP são líquidos concentrados e diluídos com anticorpos baseados em enzimas conforme necessário.

• Anticorpo enzimático xi liberadoEspecialmente para diluir anticorpos enzimáticos.

• Solução de SubstratoComo o substrato TMB, ele pode reagir com o HRP no anticorpo enzimático, gerando mudanças de cor.

• Liquido de lavagemNormalmente é um líquido concentrado, diluído proporcionalmente com água destilada ou água deionizada para lavar placas enzimáticas, remover substâncias não ligadas e reduzir a interferência de fundo.

• Liquido de terminaçãoA maioria das soluções ácidas fortes (como ácido sulfúrico) são usadas para terminar a reação de coloração do substrato, tornando a cor do líquido reativo estável e fácil de ler.

• Filme de vedação: Utilizado para cobrir placas enzimáticas durante o processo de incubação térmica para evitar a evaporação do líquido e a poluição externa.

• Manual de instruçõesDescrição detalhada do uso do kit, precauções, indicadores de desempenho, etc.

3. Requisitos de amostra

• O soroDepois da coleta de sangue, coloque a temperatura ambiente durante 2 horas ou 4 ° C durante a noite, em seguida, centrífuge a 1000 x g por 20 minutos para remover a limpeza de reposição. A coleta de sangue deve ser feita usando um equipamento descartável sem termogênio ou endotoxinas.

• Plasma sanguíneoPode-se usar o ácido tetraacetico (EDTA), hepatina, etc. como anticoagulante. Depois de 30 minutos após a coleta da amostra, centrifuge a 1.000 x g durante 15 minutos a 2 - 8 ° C para remover a limpeza.

• Cultura de célulasDepois de remover os fragmentos celulares e as impurezas, centrifugar a cultura celular com 1000 x g durante 20 minutos e remover a depuração para a detecção.

• Organização homogêneaEnxague o tecido com tampão de fosfato pré-refrigerado (PBS, 0,01 M, pH = 7,4) para remover o sangue residual. Depois de cortar o tecido, adicionar PBS em uma proporção de aproximadamente 1:9 (w/v) e moer completamente no gelo. Depois de centrifugar 5000 x g por 5 a 10 minutos, retire o limpo para a detecção.

• Se a amostra for detectada a curto prazo após a coleta, pode ser conservada a 4 ° C; Se for necessário conservar por um longo tempo, deve ser colocado a -20 ° C ou -80 ° C para congelar, e para evitar a fusão repetida, as amostras hematológicas geralmente não são adequadas para a detecção.

4. Processo operacional

• PreparaçãoRetire o kit do frigorífico e equilibre-o a temperatura ambiente 30 minutos antes. Ao mesmo tempo, dilua o líquido de lavagem concentrado com água destilada ou água desionizada de acordo com a proporção necessária.

• Adicionando: Defina buracos em branco, buracos padrão e buracos de amostra. O buraco em branco é adicionado à amostra xi, o buraco padrão é adicionado a diferentes concentrações de produtos padrão, o buraco da amostra é adicionado à amostra tratada, a quantidade de amostra por buraco é geralmente de 100 μL, misturada suavemente e cultivada a temperatura de 37 ° C por 90 minutos.

• lavagemApós o término da temperação, descarte o líquido dentro do buraco, preencha os buracos com líquido de lavagem, encha-os por 1 a 2 minutos e seque-os, repita a lavagem 5 vezes para garantir que o fundo limpe a substância não ligada.

• Anticorpos enzimáticosAdicione 100 μL de fluido de trabalho de anticorpos enzimáticos bem diluídos a cada poço e mantenha a temperatura a 37 ° C por 60 minutos.

• lavar novamente.Repita as etapas de lavagem acima.

• Visualização de coresAdicione 90 μL de solução de substrato a cada orifício, misture suavemente e mantenha a cor a 37 ° C durante 15 a 30 minutos (de acordo com a cor real).

• Terminar a reaçãoAdicione 50 μL de terminante a cada orifício e a cor da solução muda de azul para amarelo.

• LeiturasMedir a absorção (OD) de cada orifício a um comprimento de onda de 450 nm dentro de 15 minutos após a adição do líquido final.

• Calcular os resultadosLeve a concentração padrão como coordenada horizontal e o valor OD como coordenada longitudinal, desenhe a curva padrão. De acordo com o valor de OD da amostra para determinar a concentração correspondente da curva padrão, se a amostra for diluída, é necessário multiplicar o múltiplo de diluição correspondente para obter a concentração real.

5. Indicadores de desempenho

• Alcance da detecçãoDiferentes kits variam, e a faixa de detecção comum é de 31,2 a 2000 pg / mL, para atender às necessidades de detecção do conteúdo de IL-6R em várias amostras.

• sensibilidadeNormalmente, até 15,6 pg/mL ou menos podem detectar traces de IL-6R na amostra.

• EspecificaçãoÉ altamente específico para IL-6R, com quase nenhuma reação cruzada com outras substâncias, como receptores de citoquinas.

• RepetibilidadeO fator de variação dentro da placa é geralmente inferior a 10% e o fator de variação entre placas é inferior a 15%, garantindo a estabilidade e confiabilidade dos resultados de teste.

6. Atenção

• De acordo com as instruções, os reagentes de diferentes lotes de caixas não podem ser misturados.

• Usar uma sucção única durante a operação para evitar a poluição cruzada e a amostragem deve ser precisa.

• A lavagem adequada é a chave para garantir que os resultados sejam precisos, e as placas de lavagem não podem facilmente levar a resultados falsos positivos.

• A solução de substrato é sensível à luz, necessita de conservação e uso de proteção contra a luz, a reação de exibição de cor deve ser realizada em condições de proteção contra a luz.

• O líquido de terminação é corrosivo, cuidado com a proteção durante a operação, evitando o contato com a pele e os olhos.

• Recomenda-se que tanto os padrões quanto as amostras façam testes de perfuração composta para melhorar a precisão dos resultados. Este kit é usado apenas para fins de pesquisa científica e não pode ser usado para diagnóstico clínico.