Experimento de interação molecular: CLIP ultravioleta colada imunocomposição

I. Introdução técnica

CLIP (imunoprecipitação de ligação cruzada) 交联Imunosedimentação(através da combinaçãoConexão UVE métodos de co-precipitação imunológica para analisar os locais de ligação das interações entre proteínas e RNA.

II. Princípios técnicos

A tecnologia CLIP utiliza a exposição ultravioleta para que o RNA dentro da célula se entrecruze covalentemente com a proteína de ligação ao RNA (RBP), que depois enriquece fragmentos de RNA ligados a RBP específica por meio de imunodecipitação e obtém informações sobre o local de ligação ao RNA e a sequência de ligação da RBP no corpo através de passos como retrotranscrição e sequência de alto fluxo.

III. Aplicações

Estudo de interação proteína-RNA: Determinar o local de ligação e a sequência de ligação de RNA de proteínas específicas no corpo, revelando o mecanismo do papel das proteínas na regulação pós-transcrição.

Pesquisa relacionada com a doença: encontrou eventos de ligação de RNA e redes reguladoras associados à ocorrência e desenvolvimento da doença, comparando a ligação de RNA de RBP normal e em estado de doença.

Desenvolvimento de medicamentos: fornecer novos alvos e mecanismos de ação para o desenvolvimento de medicamentos que ajudem a desenvolver medicamentos que visam proteínas específicas de ligação ao RNA ou moléculas de RNA que o regulam.

Análise bioinformática: através da análise bioinformática dos dados do CLIP-seq, prever os locais de ligação e padrões de ligação das proteínas de ligação do RNA, construir uma rede de regulação do RNA, etc.

Vantagens técnicas

Detecção in situ: Capaz de capturar a interação de proteínas e RNA dentro de células vivas, refletindo o estado fisiológico do corpo.

Alta especificidade e purificação rigorosa: a purificação do complexo cruzado por anticorpos específicos ou marcadores pode remover eficazmente o RNA e as proteínas ligadas não específicamente, aumentando a credibilidade dos resultados.

Sequenciamento de alto fluxo combinado: combinado com a tecnologia de sequenciamento de alto fluxo, pode identificar os locais de ligação do RNA e a sequência de ligação do RBP em todo o genoma para obter informações ricas.

V. Tipo de amostra

Células frescas (células adesivas / células em suspensão), amostras de células após o cruzamento UV.

Necessidades de amostras

amostras de células: cerca de 1 x 10 ^ 7 (pode ser um prato de 10 cm ou armazenado em uma sonda centrífuga na forma de células em suspensão, ou uma garrafa T75);

Amostras de células cruzadas: 254 nm, 150 mJ / cm² padrão UV cruzadas células de tratamento.

Preparação da amostra e transporte

Amostras de células vivas: as amostras de células frescas mantidas em pratos / garrafas T75 / tubos centrífugos podem ser transportadas a temperatura normal (chegada no dia seguinte mais tardar), podem ser entregues ou entregues pessoalmente na cidade;

amostras de células após cruzamento: -80 ° C congelado para o transporte de gelo seco.

Reagentes necessários

Detectar com anticorpos de classe ChIP.

9. Ciclo experimental

1-2 semanas (sem sequenciamento)

X. Outros

Ao escolher a PCR RT, é necessário fornecer um local para o teste de seguimento.