Experimento Molecular Interação Molecular: Pull-down Experimento

I. Introdução técnica

Experiência Pull-DownTambém conhecido como o experimento de retirada, é uma técnica de afinidade e purificação in vitro.

II. Princípios técnicos

fixação de uma proteína a um substrato (por exemplo,SefaroseNo entanto, quando a extração celular passa pela matriz, as ligandas que podem interagir com a proteína fixadora são adsorvidas, enquanto as "impurezas" que não são adsorvidas fluem com a desidratação. As proteínas adsorbidas podem ser recuperadas alterando as condições de lavagem ou de lavagem.

III. Aplicações

Verificação de interações de proteínas conhecidas: através de um experimento Pull-down com proteínas de isca conhecidas e proteínas de presa que podem interagir, se a presença de proteínas de presa for detectada, a relação de interação entre as duas pode ser verificada.

Triagem de interações de proteínas desconhecidas: a proteína da isca é testada com uma solução celular ou outra mistura de proteínas e, em seguida, a proteína ligada é identificada para detectar proteínas desconhecidas que interagem com a proteína da isca.

Estudar a composição do complexo de proteínas: isolar o complexo de proteínas por meio de um experimento Pull-down e, em seguida, identificar as proteínas no complexo para determinar a composição do complexo de proteínas.

Estudar a interação entre proteínas e ácidos nucleicos: usando a tecnologia de DNA Pull-down e RNA Pull-down, você pode estudar a interação entre proteínas e DNA, RNA, como a ligação de fatores de transcrição e promotores, ligação de proteínas ligadas a RNA e RNA.

Vantagens técnicas

É possível determinar se a proteína de destino e a proteína de detecção podem interagir diretamente.

V. Tipo de amostra

Células frescas (células adesivas / células em suspensão), células congeladas, tecidos congelados, amostras de lisado.

Necessidades de amostras

amostras de células: cerca de 5 x 10 ^ 6 (podem ser 2 pratos de 6 cm, ou armazenados na forma de células em suspensão em um tubo centrífugo, ou 2 garrafas T25);

Congelação de tecidos: cerca de 40 mg;

Amostras de litos: concentração de proteína não inferior a 2 mg / mg, a quantidade total de proteína não inferior a 3 mg.

Preparação da amostra e transporte

amostras de células vivas: a distância mais próxima pode fornecer amostras frescas, será cultivado no prato / garrafa T25 / tubo centrífugo dentro de amostras de células frescas express temperatura normal (chegada no dia seguinte mais tardar) transporte, a cidade pode ser entregue ou pessoalmente, a distância mais longa, pode congelar as células de gelo seco transporte -80 ℃;

amostra de tecido & amostra de crachado: -80 ° C congelado para o transporte de gelo seco.

Reagentes necessários

Se o teste WB for realizado, os anticorpos correspondentes devem ser fornecidos.

9. Ciclo experimental

3-4 semanas (sem espectro de massa)

X. Outros

RNA-Pull-down、DNA-Pull-down、GST-Pull-down， Especificamente, o gênero e a proteína alvo devem ser informados, o espectro de massa de Western blot / proteína deve ser seguido e o custo da expressão in vitro da proteína de fusão deve ser calculado com base em avaliações separadas da proteína alvo específica.

Alguns experimentos de fatores de transcrição também podem usar a expressão recombinante de proteínas.

Necessidades de amostras

amostras de células: cerca de 1 x 10 ^ 7 (pode ser um prato de 10 cm ou armazenado em uma sonda centrífuga na forma de células em suspensão, ou uma garrafa T75);

Congelação de tecidos: cerca de 400 mg;

Tecido vegetal: cerca de 2g; nucleoproteína celular, fatores de transcrição purificadores, proteínas de expressão recombinante, etc.: fornecer pelo menos 50ul por membrana, a concentração não inferior a 0,5mg / ml.

Preparação da amostra e transporte

amostras de células vivas: a distância mais próxima pode ser mantida no prato / garrafa T75 / tubo centrífugo amostras de células frescas de temperatura normal express (chegada no dia seguinte mais tardar) transporte, a cidade pode ser entregue ou pessoalmente, a distância mais longa, pode congelar as células de gelo seco transporte -80 ℃;

Amostras de tecido e outras amostras líquidas: -80 ° C congelado para transporte de gelo seco.

Reagentes necessários

Anticorpos específicos ligados a proteínas acima de 50 ul, concentrações superiores a 0,5 mg / ml.

9. Ciclo experimental

2-3 semanas

X. Outros

Sequência da sonda Se não houver sequência da sonda, forneça informações ou literatura relacionadas com a proteína de ligação ao DNA.