Experimento de interação molecular: CUT& TAG corte direcionado e rotulagem

I. Introdução técnica

CUT&TAG é uma técnica de análise epigenômica de alta sensibilidade baseada em corte e rotulagem de cromatina direcionada guiada por anticorpos, que supera os gargalos de gargalo de baixa sensibilidade, alto ruído de fundo e grande demanda de amostras do ChIP-seq tradicional, e pode analisar características de cromatina como modificação de histonas e ligação de fatores de transcrição a nível celular, tornando-se uma nova pesquisa epigenética.direção。

II. Princípios técnicos

A CUT&TAG permite uma análise precisa da cromatina através de quatro reações-chave:

Posicionamento de anticorpos:O monoantib específico (por exemplo, anticorpos H3K4me3) liga-se à região da cromatina alvo, e o biantib da proteína A/G transporta o complexo da transferase Tn5 (com junção de sequenciamento).

Corte direcionado e rotulagem:A transferase Tn5 faz o corte de dupla cadeia de DNA da cromatina alvo com ligação à junção, sob a orientação de anticorpos, com uma faixa de corte de aproximadamente 50-300 bp de cada lado do local alvo.

Liberação de fragmentos de DNA:A protease K digere a cromatina reticulada, liberando fragmentos de DNA ligados.

Construção e Sequência de Bibliotecas:A PCR expande o segmento alvo para construir a biblioteca de sequência Illumina com profundidade de sequência: ~20 milhões de leituras/amostra (50% menos do que o ChIP-seq).

III. Aplicações

A CUT&TAG revela diferenças epigenéticas em diferentes subpopulações no microambiente tumoral a nível unicelular.

Por exemplo:

Câncer de mama triplo negativo: Superreforçadores regulados pelo FOXA1 foram detectados por CUT & TAG de células únicas ativados especificamente em subtipos basais que impulsionam a expressão de genes chave EMT (Transformação epitelial-intermescal), como SNAI1, promovendo a metastase.

Leucemia medular aguda: rastreamento de amostras de medula óssea em pacientes com recidiva para identificar mudanças dinâmicas na modificação H3K4me1 em células-tronco CD34 +, que antecipam a geração de resistência à quimioterapia, fornecendo novos alvos para tratamentos aparentemente direcionados.

Epi-reprogramação do desenvolvimento embrionário: CUT&TAG rastreia o processo dinâmico de construção de modificações histológicas no desenvolvimento embrionário precoce.

Embriões de camundongos antes da cama: H3K9me3 foi descoberto a começar a se depositar na fase de 2 células, marcando com prioridade regiões de transposons reversos (como LINE-1), uma modificação que mantém a estabilidade do genoma inibindo a atividade dos transposons.

Células-tronco embrionárias humanas: mapeamento dinâmico do H3K27ac na neurodiferenciação, localização de subredes aprimoradas da regulação SOX2 e OCT4, revelando nós-chave de saída pluripotente.

Regulação da função das células imunológicas: a base aparente para analisar a diferenciação e o estado funcional das células T.

Esgotamento de células T: Em modelos de infecção viral crônica, H3K27ac de células T CD8+ esgotadoras foi encontrado anormalmente enriquecido nos locais PD-1 e TIM-3, que a atividade de filhos potenciadores é regulada diretamente pelo fator de transcrição TOX.

Células T reguladoras (Treg): ATAC-seq combinado revelou que FOXP3 estabiliza a função inibitória das células Treg através da remodelação da modificação de H3K4me3, um processo que depende da inibição sinergica de H3K27me3 mediada por EZH2.

Vantagens técnicas

Alta sensibilidade (detecção a nível celular de 100): a transferase Tn5 corta e conecta a junção de sequência diretamente no local alvo para evitar a perda aleatória causada pela fragmentação de DNA (quebra por ultra-som) no ChIP-seq. Em comparação com o ChIP-seq, a relação sinal-ruído do CUT&TAG foi 8 vezes maior (S/N=12:1 vs 1,5:1), aumentando o número de picos de diferença detectados em 40%.

Resolução de base única e posicionamento preciso: o complexo anticorpo-Tn5 corta apenas o DNA próximo ao local de ligação (± 50 bp), enquanto a ruptura por ultra-som de ChIP-seq produz segmentos aleatórios de 200-500 bp. Na análise de locais de combinação p53, o CUT&TAG detectou um único pico estreito (largura do pico ≈ 30 bp), enquanto o ChIP-seq apresentou um pico amplo (largura do pico ≈ 200 bp), que pode ser localizado com precisão no centro da sequência base TTGCCT.

Compatibilidade unicelular com epiomônica espacial: a plataforma conjunta 10x Genomics envolve células individuais com o complexo anticorpo-Tn5 em gotas de óleo através do microfluido, permitindo a construção de mapas unicelulares H3K27ac (Nature Methods, 2022).

A tecnologia Spatial CUT&Tag recentemente desenvolvida pode localizar a distribuição subestrutural de H3K4me3 em cortes de tecido, por exemplo, visualizando modificações relacionadas à atividade dos neurônios do hipocampo em cortes cerebrais de ratos.

V. Tipo de amostra

Células frescas (células adesivas / células em suspensão), células congeladas, tecidos congelados.

Necessidades de amostras

amostras de células: cerca de 10.000 (pode ser um buraco em uma placa de 24 buracos ou armazenado na forma de células em suspensão em um tubo centrífugo);

Congelação do tecido: cerca de 10-20 mg.

Preparação da amostra e transporte

Amostras de células vivas: amostras frescas podem ser fornecidas a uma distância mais próxima, amostras de células frescas cultivadas dentro de um prato / centrifugador serão transportadas a temperatura normal (até o dia seguinte), podem ser entregues ou entregues pessoalmente na cidade; Distância mais longa, pode congelar células de -80 ° C transporte de gelo seco;

Amostras de tecido: -80 ° C congelado para transporte de gelo seco.

Reagentes necessários

Anticorpos de classe ChIP (anticorpos de classe IF podem ser selecionados quando não houver)

9. Ciclo experimental

1-2 semanas (sem sequenciamento)

X. Outros

Detecção Rrealtime PCR/Sequenciamento