Experimento de interação molecular: RIP (Imunoprecipitação de RNA)

I. Introdução técnica

A técnica RIP (RNA Immunoprecipitation, Imunoprecipitação de RNA) é um método experimental essencial para estudar as interações intracelulares de RNA com proteínas que podem revelar os mecanismos funcionais da proteína ligadora de RNA (RBP) na regulação pós-transcrição.

II. Princípios técnicos

O RIP usa anticorpos contra a proteína alvo para precipitar o complexo de RNA-proteína correspondente, purificando o RNA ligado ao complexo por isolação, validação por RT-PCR ou análise de sequenciamento, resultando em resultados biologicamente mais convincentes.

III. Aplicações

Mecanismo básico: Analisar a função das proteínas ligadoras de RNA (como AGO2, complexo Polycomb) e redes reguladoras de RNA.

Estudo da doença: comparar as diferenças de interação de RNA-proteína em amostras normais e descobrir biomarcadores potenciais (como lncRNA relacionado ao câncer).

Desenvolvimento de medicamentos: avaliar os efeitos dos medicamentos sobre a interação RNA-proteína e acelerar a triagem de alvos.

Vantagens técnicas

Alta sensibilidade: pode detectar interações fracas de RNA de baixa abundância com proteínas.

Ampla gama dinâmica: de um pequeno número de células (por exemplo, 5 x 107) a amostras de tecido complexas.

Combinação multiomética: combinar RNA-Seq, CLIP-Seq ou ChIP-Seq para construir uma rede de regulação multidimensional.

V. Tipo de amostra

Células frescas (células adesivas / células em suspensão), células congeladas, tecidos congelados, amostras de células pós-cruzadas.

Necessidades de amostras

amostras de células: cerca de 1 x 10 ^ 7 (pode ser um prato de 10 cm ou armazenado em uma sonda centrífuga na forma de células em suspensão, ou uma garrafa T75);

Congelação de tecidos: cerca de 70 mg; amostras de células cruzadas: células tratadas com 1% de formaldeído cruzado.

Preparação da amostra e transporte

amostras de células vivas: a distância mais próxima pode ser mantida no prato / garrafa T75 / tubo centrífugo amostras de células frescas de temperatura normal express (chegada no dia seguinte mais tardar) transporte, a cidade pode ser entregue ou pessoalmente, a distância mais longa, pode congelar as células de gelo seco transporte -80 ℃;

amostra de tecido & amostra de células após cruzamento: -80 ° C congelamento para o transporte de gelo seco.

Reagentes necessários

Detectar com anticorpos de classe ChIP.

9. Ciclo experimental

1-2 semanas (sem sequenciamento)

X. Outros

Ao escolher a PCR RT, é necessário fornecer um local para o teste de seguimento.

Etapas específicas das células de reticulação de formaldeído: 1 adicionar a concentração final de formaldeído de 1% no prato celular, incubar a 37 ° C por 10 minutos; ② Lave as células duas vezes com DPBS gelado contendo [PMSF 1mM, inibidor de peptidase 1μg / ml e pepstatina A 1μg / ml]. ② Raspa as células em um DPBS gelado de 2 ml contendo inibidores de protease e transfira para um tubo centrífugo para congelamento.